Диссертация (1145914), страница 17
Текст из файла (страница 17)
pastoris оказываются сильно затруднены,поскольку эти дрожжиявляютсяоблигатными аэробами и не способнысуществовать без митохондрий. Полученные в нашей работе данные о влияниипролина на активность генов пероксисом открывают новый подход к изучениюкоординированной регуляции пероксисом и митохондрий у дрожжей.ОбработкаклетокP.pastorisрапамициномприводилакполномуисчезновению регуляции промотора АОХ1 на средах с разными источниками азота.Это позволяет предположить, что Tor-киназа играет ключевую роль в установленииподобной регуляции. Добавление рапамицина приводило к увеличению активностипромотора АОХ1 в средах ММ с пролином до уровней, наблюдаемых в средах ссульфатом аммония в качестве источника азота. Можно сделать вывод, чтопромотор гена АОХ1 регулируется пролином за счёт механизмов репрессии.Делеции различной протяженности в составе промотора гена АОХ1 изменялиего активность, но не влияли на его регуляцию пролином.
Делеция в участке от –168до –98 н. приводила к столь сильному снижению активности промотора, что неудалось получить достоверных различий между результатами измерения егоактивности в средах ММ с сульфатом аммония и пролином. Это связано с тем, чтоданный фрагмент промотора АОХ1 содержит сайты связывания белка Mxr1 иявляется критичным для его индукции метанолом.
Таким образом участок Спромотора АОХ1 оказался достаточен для репрессии его активности в средах спролином. Можно предположить, что репрессия промотора осуществляется либо засчёт регуляции активности самого белка Mxr1, либо за счёт связывания некоего ТФ,распознающего те же последовательности, что и Mxr1, но являющегосярепрессором. Косвенным подтверждением этих предположений могут служитьрезультаты, полученные с помощью репортерных систем, содержавших ген КФ подконтролем промоторов АОХ1 и АОХ2.
Несмотря на то, что последовательности этих119промоторов абсолютно различны, их регуляция пролином осуществляется сходнымобразом.Недавно был обнаружен белок 14-3-3, который регулирует активность Mxr1ру P. pastoris, и ингибирует экспрессию MUT- и PEX- генов. Этот белок являетсягомологом белка Bmh1 дрожжей S. cerevisiae, который участвует в обеспеченииретроградной регуляции в клетке и работе рапамицин-чувствительных сигнальныхпутей (Parua et al., 2012). Другим кандидатом на роль белка, осуществляющегорепрессию MUT- и PEX- генов в средах с пролином является недавно обнаруженныйбелок Rop1, являющийся репрессором фосфоенолпируваткарбоксилазы.
Показно,что данный белок осуществляет репрессию генов, вовлеченных в метаболизмметанола в полных средах содержащих пептон и дрожжевой экстракт. Данный белокраспознаёт тот же сайт связывания в составе промотора АОХ1, что итранскрипционный активатор Mxr1 и конкурирует с ним (Kumar & Rangarajan,2012).Помимо наличия регуляции MUT- и PEX- генов источником азота былообнаружено, что экспрессия этих генов так же изменяется в ответ на дефицитортофосфата в среде. Активность генов АОХ1, АОХ2, DAK, DAS, FLD и PpPEX5возрастает в средах с высокими концентрациями ортофосфата.
Анализ активностирепортерной КФ у штаммов, содержавших делеции различной протяженности всоставе промотора гена АОХ1 показал, что делеция области, ограниченной сайтомрестрикции SacI изменяет его регуляцию в зависимости от концентрацииортофосфата.У дрожжей S. сerevisiae ключевую роль в регуляции метаболизма фосфораиграет циклинзависимая киназа Pho85p. При этом одной из мишеней Pho85pявляется упомянутый ранее белок Bmh1 (регуляторный белок 14-3-3) (Sopko et al.,2006).На рисунке 46 представлена модель регуляции экспрессии гена АОХ1 у P.pastoris построенная исходя из данных, полученных в данной работе.120Рисунок 46. Модель регуляции экспрессии MUT- и PEX- генов у P.
pastoris взависимости от типа источника азота и концентрации ортофосфата в среде. 1) Всредах с метанолом добавление глутамата или пролина приводит к снижениюактивности промоторов MUT- и PEX- генов. Участок от –168 до –98 н. в промотореАОХ1 достаточен для обеспечения его регуляции пролином. Данная регуляцияосуществляетсянауровнетранскрипциипомеханизмурепрессии.Предположительно в роли репрессоров могут выступать белок семейства 14-3-3(гомолог белка Bmh1 дрожжей S. cerevisiae) или ТФ Rop1p. Ключевую роль впередаче сигнала о наличие пролина в среде играет Tor-киназа. У S. cerevisiae онаучаствуетв обеспечении регуляции генов азотного метаболизма, генов,кодирующих ферменты цикла Креббса, а так же генов, чьи белковые продукты121вовлечены в функционирование митохондрий.
Полученные нами данные орепрессии PEX- генов P. pastoris пролином, который метаболизируется вмитохондриях, позволяют предположить наличие координированной регуляциимитохондрий и пероксисом у этих дрожжей. При этом ключевую роль вобеспечении подобной регуляции играет Tor-киназа. 2) В средах с высокимиконцентрациями ортофосфата активность промотора АОХ1 возрастает. Такимобразомнедостатокортофосфатаявляетсялимитирующимфактором,регулирующим активность генов метаболизма метанола у P. pastoris. УчастокпромотораАОХ1 от –997 до –771 н. связан с его регуляцией ортофосфатом.Экспериментысиспользованиемингибиторафлавопиридолапозволяютпредположить, что в обеспечение данной регуляции у дрожжей P.
pastoris вовлеченациклинзависимая киназа.Метилотрофные дрожжи P. pastoris широко используются в биотехнологиидля синтеза белков различного происхождения. При этом очень важно иметьвозможность поддерживать оптимальный баланс между уровнями экспрессиигетерологичного гена, ростом и жизнеспособностью клеток дрожжей.
Для решенияэтих задач важно пониманиемолекулярных механизмов,обеспечивающихрегуляцию генов у P. pastoris. Наши результаты показали, что дрожжи P. pastorisобладают сигнальной системой, которая координированно регулирует экспрессиюгенов ферменов метаболизма метанола и генов, кодирующих белки пероксисом. Этасистема не только реагирует на изменение источника азота в среде, но иобеспечивает оптимальные уровни экспрессии MUT- и PEX- генов в средах сразличными концентрациями ортофосфата.
Всё это позволяет предположить, чтоданные гены формируют регулон.1226. Выводы1. Экспрессия MUT-генов (АОХ1,2, САТ, DAK, DAS1, FLD и FGH), а так жеPEX-генов (PpPEX5, PpPEX8, PpPEX14, и PpPEX1) зависит от типаисточника азота в среде. Репрессия MUT- и PEX-генов наблюдается в средахс пролином и глутаматом.2. Уровни экспрессии генов MUT-генов (AOX1, AOX2, DAS, DAK, FLD), а также PEX-генов (PpPEX5) зависят от концентрации фосфата в среде ивозрастают по мере её увеличения.3. Анализ промотора AOX1 выявил участки, необходимые для его регуляцииисточником азота и концентрацией фосфата.
Участок промотора от –168 до–98 н. достаточен для установления его регуляции в зависимости от типаисточника азота. Участок от -997 до -771 н. важен для установления егорегуляции в зависимости от концентрации фосфата в среде.4. Изучение влияния ингибиторов киназ рапамицина и флавопиридола нарегуляциюпромоторагенаАОХ1азотомифосфатомпозволяетпредположить участие в Тоr и циклинзависимых киназ в этих процессах.5.
MUT- и PEX-гены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизмеметанола и белки пероксисом, координировано регулируются в ответ наизменение типа источника азота и изменение концентрации фосфата иформируют регулон.1237. Список используемых сокращенийВ настоящей работе приняты следующие сокращения:Arg – аргинин;(NH4)2SO4 , NH4+ – сульфат аммония, аммоний;Glu – глутаминовая кислота, глутамат;Gln – глутамин;Mut+ – methanol utilization plus, фенотип P. pastoris, характеризующийсянормальным ростом на среде с метанолом;MutS – methanol utilization slow, замедленный рост на среде с метанолом;-Mut – methanol utilization minus, отсутствие роста на среде с метанолом;Urea – мочевина;Pi – ортофосфат;Pro – пролин;НАД+ – никотинамидадениндинуклеотид;НАДФ+ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат;NCR – nitrogen catabolite repression, азотная катаболитная репрессия;P5C – пирролин-5-карбоксилатКФ – кислая фосфатаза;п.о., т.п.о.
– пар оснований, тысяч пар оснований;н. – нуклеотидов;ПЦР – полимеразная цепная реакция;ТФ – транскрипционный фактор;ФАД – флавинадениндинуклеотида;ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота.1248. Список цитируемой литературы1. Гланц, С. Б. Медико - биологическая статистика / С. Б. Гланц. – М.: Практика,1998. – 459 с.2. Ермилова, Е.В. Количественный анализ экспрессии генов / Е.В.
Ермилова,Ж.М. Залуцкая, Т.В. Лапина, М.Ф.Шишова. – СПб.:Тесса, 2011. – 122 с.3. Захаров, И.А. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов / И. А.Захаров, С.А. Кожин, Т.Н. Кожина. – Л.: Наука, 1984. – 142 с.4. Кожин,С.А.Изучениегенетическогоконтроляэкспрессиигенов,контролирующих синтез кислых фосфатаз у дрожжей / С.А. Кожин, М.Г.Самсонова, Е.В. Самбук // Исследования по генетике.- 1986. – Т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
