Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1145914), страница 17

Файл №1145914 Диссертация (Генетический контроль регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pastoris) 17 страницаДиссертация (1145914) страница 172019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 17)

pastoris оказываются сильно затруднены,поскольку эти дрожжиявляютсяоблигатными аэробами и не способнысуществовать без митохондрий. Полученные в нашей работе данные о влияниипролина на активность генов пероксисом открывают новый подход к изучениюкоординированной регуляции пероксисом и митохондрий у дрожжей.ОбработкаклетокP.pastorisрапамициномприводилакполномуисчезновению регуляции промотора АОХ1 на средах с разными источниками азота.Это позволяет предположить, что Tor-киназа играет ключевую роль в установленииподобной регуляции. Добавление рапамицина приводило к увеличению активностипромотора АОХ1 в средах ММ с пролином до уровней, наблюдаемых в средах ссульфатом аммония в качестве источника азота. Можно сделать вывод, чтопромотор гена АОХ1 регулируется пролином за счёт механизмов репрессии.Делеции различной протяженности в составе промотора гена АОХ1 изменялиего активность, но не влияли на его регуляцию пролином.

Делеция в участке от –168до –98 н. приводила к столь сильному снижению активности промотора, что неудалось получить достоверных различий между результатами измерения егоактивности в средах ММ с сульфатом аммония и пролином. Это связано с тем, чтоданный фрагмент промотора АОХ1 содержит сайты связывания белка Mxr1 иявляется критичным для его индукции метанолом.

Таким образом участок Спромотора АОХ1 оказался достаточен для репрессии его активности в средах спролином. Можно предположить, что репрессия промотора осуществляется либо засчёт регуляции активности самого белка Mxr1, либо за счёт связывания некоего ТФ,распознающего те же последовательности, что и Mxr1, но являющегосярепрессором. Косвенным подтверждением этих предположений могут служитьрезультаты, полученные с помощью репортерных систем, содержавших ген КФ подконтролем промоторов АОХ1 и АОХ2.

Несмотря на то, что последовательности этих119промоторов абсолютно различны, их регуляция пролином осуществляется сходнымобразом.Недавно был обнаружен белок 14-3-3, который регулирует активность Mxr1ру P. pastoris, и ингибирует экспрессию MUT- и PEX- генов. Этот белок являетсягомологом белка Bmh1 дрожжей S. cerevisiae, который участвует в обеспеченииретроградной регуляции в клетке и работе рапамицин-чувствительных сигнальныхпутей (Parua et al., 2012). Другим кандидатом на роль белка, осуществляющегорепрессию MUT- и PEX- генов в средах с пролином является недавно обнаруженныйбелок Rop1, являющийся репрессором фосфоенолпируваткарбоксилазы.

Показно,что данный белок осуществляет репрессию генов, вовлеченных в метаболизмметанола в полных средах содержащих пептон и дрожжевой экстракт. Данный белокраспознаёт тот же сайт связывания в составе промотора АОХ1, что итранскрипционный активатор Mxr1 и конкурирует с ним (Kumar & Rangarajan,2012).Помимо наличия регуляции MUT- и PEX- генов источником азота былообнаружено, что экспрессия этих генов так же изменяется в ответ на дефицитортофосфата в среде. Активность генов АОХ1, АОХ2, DAK, DAS, FLD и PpPEX5возрастает в средах с высокими концентрациями ортофосфата.

Анализ активностирепортерной КФ у штаммов, содержавших делеции различной протяженности всоставе промотора гена АОХ1 показал, что делеция области, ограниченной сайтомрестрикции SacI изменяет его регуляцию в зависимости от концентрацииортофосфата.У дрожжей S. сerevisiae ключевую роль в регуляции метаболизма фосфораиграет циклинзависимая киназа Pho85p. При этом одной из мишеней Pho85pявляется упомянутый ранее белок Bmh1 (регуляторный белок 14-3-3) (Sopko et al.,2006).На рисунке 46 представлена модель регуляции экспрессии гена АОХ1 у P.pastoris построенная исходя из данных, полученных в данной работе.120Рисунок 46. Модель регуляции экспрессии MUT- и PEX- генов у P.

pastoris взависимости от типа источника азота и концентрации ортофосфата в среде. 1) Всредах с метанолом добавление глутамата или пролина приводит к снижениюактивности промоторов MUT- и PEX- генов. Участок от –168 до –98 н. в промотореАОХ1 достаточен для обеспечения его регуляции пролином. Данная регуляцияосуществляетсянауровнетранскрипциипомеханизмурепрессии.Предположительно в роли репрессоров могут выступать белок семейства 14-3-3(гомолог белка Bmh1 дрожжей S. cerevisiae) или ТФ Rop1p. Ключевую роль впередаче сигнала о наличие пролина в среде играет Tor-киназа. У S. cerevisiae онаучаствуетв обеспечении регуляции генов азотного метаболизма, генов,кодирующих ферменты цикла Креббса, а так же генов, чьи белковые продукты121вовлечены в функционирование митохондрий.

Полученные нами данные орепрессии PEX- генов P. pastoris пролином, который метаболизируется вмитохондриях, позволяют предположить наличие координированной регуляциимитохондрий и пероксисом у этих дрожжей. При этом ключевую роль вобеспечении подобной регуляции играет Tor-киназа. 2) В средах с высокимиконцентрациями ортофосфата активность промотора АОХ1 возрастает. Такимобразомнедостатокортофосфатаявляетсялимитирующимфактором,регулирующим активность генов метаболизма метанола у P. pastoris. УчастокпромотораАОХ1 от –997 до –771 н. связан с его регуляцией ортофосфатом.Экспериментысиспользованиемингибиторафлавопиридолапозволяютпредположить, что в обеспечение данной регуляции у дрожжей P.

pastoris вовлеченациклинзависимая киназа.Метилотрофные дрожжи P. pastoris широко используются в биотехнологиидля синтеза белков различного происхождения. При этом очень важно иметьвозможность поддерживать оптимальный баланс между уровнями экспрессиигетерологичного гена, ростом и жизнеспособностью клеток дрожжей.

Для решенияэтих задач важно пониманиемолекулярных механизмов,обеспечивающихрегуляцию генов у P. pastoris. Наши результаты показали, что дрожжи P. pastorisобладают сигнальной системой, которая координированно регулирует экспрессиюгенов ферменов метаболизма метанола и генов, кодирующих белки пероксисом. Этасистема не только реагирует на изменение источника азота в среде, но иобеспечивает оптимальные уровни экспрессии MUT- и PEX- генов в средах сразличными концентрациями ортофосфата.

Всё это позволяет предположить, чтоданные гены формируют регулон.1226. Выводы1. Экспрессия MUT-генов (АОХ1,2, САТ, DAK, DAS1, FLD и FGH), а так жеPEX-генов (PpPEX5, PpPEX8, PpPEX14, и PpPEX1) зависит от типаисточника азота в среде. Репрессия MUT- и PEX-генов наблюдается в средахс пролином и глутаматом.2. Уровни экспрессии генов MUT-генов (AOX1, AOX2, DAS, DAK, FLD), а также PEX-генов (PpPEX5) зависят от концентрации фосфата в среде ивозрастают по мере её увеличения.3. Анализ промотора AOX1 выявил участки, необходимые для его регуляцииисточником азота и концентрацией фосфата.

Участок промотора от –168 до–98 н. достаточен для установления его регуляции в зависимости от типаисточника азота. Участок от -997 до -771 н. важен для установления егорегуляции в зависимости от концентрации фосфата в среде.4. Изучение влияния ингибиторов киназ рапамицина и флавопиридола нарегуляциюпромоторагенаАОХ1азотомифосфатомпозволяетпредположить участие в Тоr и циклинзависимых киназ в этих процессах.5.

MUT- и PEX-гены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизмеметанола и белки пероксисом, координировано регулируются в ответ наизменение типа источника азота и изменение концентрации фосфата иформируют регулон.1237. Список используемых сокращенийВ настоящей работе приняты следующие сокращения:Arg – аргинин;(NH4)2SO4 , NH4+ – сульфат аммония, аммоний;Glu – глутаминовая кислота, глутамат;Gln – глутамин;Mut+ – methanol utilization plus, фенотип P. pastoris, характеризующийсянормальным ростом на среде с метанолом;MutS – methanol utilization slow, замедленный рост на среде с метанолом;-Mut – methanol utilization minus, отсутствие роста на среде с метанолом;Urea – мочевина;Pi – ортофосфат;Pro – пролин;НАД+ – никотинамидадениндинуклеотид;НАДФ+ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат;NCR – nitrogen catabolite repression, азотная катаболитная репрессия;P5C – пирролин-5-карбоксилатКФ – кислая фосфатаза;п.о., т.п.о.

– пар оснований, тысяч пар оснований;н. – нуклеотидов;ПЦР – полимеразная цепная реакция;ТФ – транскрипционный фактор;ФАД – флавинадениндинуклеотида;ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота.1248. Список цитируемой литературы1. Гланц, С. Б. Медико - биологическая статистика / С. Б. Гланц. – М.: Практика,1998. – 459 с.2. Ермилова, Е.В. Количественный анализ экспрессии генов / Е.В.

Ермилова,Ж.М. Залуцкая, Т.В. Лапина, М.Ф.Шишова. – СПб.:Тесса, 2011. – 122 с.3. Захаров, И.А. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов / И. А.Захаров, С.А. Кожин, Т.Н. Кожина. – Л.: Наука, 1984. – 142 с.4. Кожин,С.А.Изучениегенетическогоконтроляэкспрессиигенов,контролирующих синтез кислых фосфатаз у дрожжей / С.А. Кожин, М.Г.Самсонова, Е.В. Самбук // Исследования по генетике.- 1986. – Т.

Характеристики

Тип файла
PDF-файл
Размер
3,48 Mb
Предмет
Высшее учебное заведение

Список файлов диссертации

Генетический контроль регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pastoris
Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6392
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее