Диссертация (1145914), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Клетки переносили в среды с глицерином иметанолом, а так же их смесью в качестве источников углерода. Так какрепрессия глицерином и индукция метанолом осуществляется за счёт отдельныхмеханизмов, в среде со смесью этих источников углерода будет наблюдаться ирепрессия и индукция промотора. Но только если механизм репрессии будетингибирован будет наблюдаться активация промотора АОХ1. К опытным пробамдобавляли рапамицин. Через 40 часов культивирования измеряли удельнуюактивность КФ (Рис. 19).75Рисунок 19. Удельная активность КФ (OD410/OD550), секретируемойштаммом tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) при культивировании всредах с различными источниками углерода.
Символом * обозначено достоверноеразличие удельной активности КФ (p-value < 0,01).Добавление рапамицина не влияет репрессию промоторагена АОХ1глицерином. На среде с рапамицином, содержавшей смесь метанола и глицерина,активность КФ практически не наблюдали, как и в случае контрольных образцов.Следовательно механизм репрессии промотора АОХ1 в средах с пролином, вкоторые вовлечена Tor-киназа, отличается от тех, что обеспечивают егорепрессию источниками углерода.764.5Получение штаммов P. pastoris устойчивых к рапамицинуУ дрожжей S.
cerevisiae мутации, характеризующиеся устойчивостью кдействию рапамицина, возникают в генах, кодирующих белки Tor-киназногокомплекса. Получение мутантов и их исследование методами генетическогоанализа является одним из основных подходов к исследованию механизмовпередачи сигнала о качестве источника азота и поиска регуляторных белков,вовлеченных в азотную катаболитную репрессию.К сожалению, у дрожжей P.
pastoris генетический анализ в значительнойстепени затруднен особенностями их жизненного цикла. Дрожжи P. pastorisнаиболее стабильны в вегетативном гаплоидном состоянии. Спаривание клетокиндуцируется в неблагоприятных условиях, в частности при азотном голодании.Диплоидные штаммы P. pastoris чрезвычайно нестабильны и быстро спорулируют(Hicks & Herskowitz, 1976).
P. pastoris являются гомоталличными, что сильнозатрудняет проведение генетических манипуляций. В частности это свойствозначительно усложняет генетический анализ мутантов. Так же при работе соштаммами P. pastoris часто наблюдаются различные нарушения при споруляции инизкая жизнеспособность аскоспор (Ogrydziak, 1988).Мутанты, устойчивые к рапамицину получали у штамма tr2-4-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4) с помощью УФ. Клетки выращивали на среде Md сдобавлением рапамицина. Было отобрано 43 мутанта, характеризовавшихсяустойчивостью к данному антибиотику.Так как проведение генетического анализа не представлялось возможным,исследовали рост полученных мутантов, высевая их в серии разведений на средыMM с метанолом и сульфатом аммония или пролином в качастве источниковазота (таблица 5).77Таблица 5.Рост штаммов P.
pastoris на средах с метанолом и разными источникамиазота.Среда MM ссульфатомаммония+рапамицинСреда MM спролином+рапамицинtr2-4-GS115R1-tr2-4-GS115R2-tr2-4-GS115Все полученные мутанты условно были разделены на две фенотипическиегруппы. В первой группе, включающей 41 мутанта из 43, скорость росташтаммов на средах MM с сульфатом аммония и MM с пролином не отличалась отдикого типа. 2 мутанта, относящихся ко второй группе характеризовалисьзамедленным ростом, что в особенности проявлялось на средах с сульфатомаммония. Для дальнейших исследований было отобрано по одному мутанту изкаждой фенотипической группы - R1-tr2-4-GS115 (RapR phox his4::PAOX1-PHO5HIS4) и R2-tr2-4-GS115 (RapR phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) (Рис.
20).78Рисунок 20. Кривые роста штаммов tr2-4-GS115, R1-tr2-4-GS115 и R2-tr2-4GS115 в жидких средах MM с метанолом и различными источниками азота.Для оценки влияния мутаций характеризующихся устойчивостью крапамицину штаммы R1-tr2-4-GS115 и R2-tr2-4-GS115, а так же исходный штаммtr2-1-GS115 культивировали 48 часов в средах MG с глицерином и пролином исульфатомаммониявкачествеисточниковазота.Затемцентрифугировали и переносили клетки в среды с метаноломкультурыдля индукциипромотора AOX1. Культивирование длилось 40 часов с добавлением рапамицинав половину проб. Результаты измерения удельной активности КФ представленына рисунке 21.79*****Рисунок 21. Удельная активность КФ (OD410/OD550), секретируемой исходнымштаммом штаммами tr2-4-GS115 и рапамицинустойчивыми мутантами R1-tr2-4GS115 и R2-tr2-4-GS115 при культивировании в среде с метанолом в зависимостиот типа источника азота и наличия рапамицина.
Символом * обозначенодостоверное различие удельной активности КФ (p-value < 0,01).Было показано, что у полученных мутантов R1-tr2-4-GS115 и R2-tr2-4-GS115добавление рапамицина в среду не влияло на регуляцию промотора АОХ1, вотличие от контрольного штамма, где регуляция полностью исчезала. Так как умутантов сохраняется репрессия пролином, то это означает, что полученныемутации затрагивают гены, продукты которых работают в данном сигнальномпути. В дальшейшем будет проведён генетический анализ этих мутантов сиспользованием штаммов P. pastoris с разными ауксотрофностями. Такие штаммыуже получены в лаборатории биохимической генетики (Музаев и др., 2015).804.6 .
Влияние делеции в гене PpURE2 на регуляцию промотора генаAOX1В регуляции генов метаболизма азота и других генов, подверженных азотнойрегуляции важную роль играют GATA-факторы (Marzluf, 1997). При этомосновным позитивным регулятором является белок Gln3, который в условияхрепрессии находится в цитоплазме в комплексе с Ure2p. Активность этихфакторов зависит в первую очередь от Tor-киназного комплекса (Loewith & Hall,2011). Поэтому следующим этапом стало исследование роли белков являющихсямишенями Tor-киназного комплекса в передаче сигнала о типе источника азота.Был проведен биоинформатический анализ генома дрожжей P.
pastoris, в ходекоторого с помощью алгоритма BLAST искали гены, кодирующие белки –мишени Tor-киназного комплекса, гомологичные соответствующим белкамдрожжей S. cerevisiae. В первую очередь исследовали белки, вовлеченные впередачу сигнала о качестве источника азота GATA-факторы Gln3p, Gat1p,Dal80p, Gzf3p и их негативный регулятор Ure2p.Геном дрожжей P. pastoris составляет около 9,3 млн. п.о. и представлен начетырех хромосомах. В его составе выявлено 5313 генов, кодирующих белки (DeSchutter et al., 2009). Первые сборки генома стали доступны с начала 2000-х годови использовались в ряде работ, посвящённых изучению их транскриптома (Gasseret al., 2007), протеома (Dragosits et al., 2009) и различных метаболических путей.Однако первоначально доступ к данным последовательностям был коммерческими требовал заключения ограничительных договоров, в которых было прописано,чтовсяинформацияопоследовательностяхдолжнаоставаласьконфиденциальной.
Лишь в 2009 году в открытом доступе появились геномыштаммов GS115 (Schutter et al., 2009) и DSMZ70382 (Mattanovich et al., 2009a) иих соответствующие аннотации. Сегодня эти последовательности доступны вбазах данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ ?term=pichia%20pastoris),атакженасайтахhttp://bioinformatics.psb.ugent.be/http://www.pichiagenome.org (Mattanovich et al., 2009b).webtools/bogas/и81В таблице 6 представлены результаты выравнивания аминокислотныхпоследовательностей последовательностей белков Tor1, Tor2, Gln3, Gat1, Dal80,Gzf3 и Ure2 дрожжей S.
cerevisiae, а так же нуклеотидных последовательностейсоответствующих генов и гомологичных последовательностей, обнаруженных уP. pastoris.Таблица 6.Результаты поиска и сравнения последовательностей белков Tor1, Tor2, Gln3,Gat1, Dal80, Gzf3 и Ure2 дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, а так женуклеотидных последовательностей соответствующих генов.ПерекрываГенГенP.
pastorisСтепеньние посл-S. cerevi- идентичности тей белков,siaeбелков, %%ПерекрываСтепеньние, посл-идентичноститей генов,генов, %%PpURE2URE268806866PpTORTOR155976853PpTORTOR257966947PpGLN3GLN37611756PpGAT1GAT155271002PpDAL80DAL80N/AN/AN/AN/APpGZF3GZF3N/AN/AN/AN/AБелкам Tor1 и Tor2 соответствовал лишь один белок у дрожжей P. pastoris.Это, скорее всего, объясняется тем, что дрожжи S. cerevisiae в ходе эволюциипретерпелидупликациюгенома.БелкиP.pastoris,имеющиесходные82последовательности с белками Gln3 и Gat1, обладали низкой степеньюидентичности, а гомологи белков Dal80 и Gzf3 вообще не были выявлены.
Толькодля белка Ure2, являющегося регулятором транскрипционного фактора Gln3 у S.cerevisiae, был выявлен гомолог P. pastoris с высокой степенью идентичности.Для изучения роли белка Ure2 в регуляции промотора гена АОХ1 был полученштамм P. pastoris делецией в гене PpURE2. Последовательность гена PpURE2была амплифицирована с помомощью ПЦР с праймерами FPpURE2 и FPpURE2по матрице хромосомной ДНК P. pastoris. Наработанные продукты быликлонированы в вектор pJET1.2. Последовательность гена ZeoR (Sh ble),обеспечивающего устойчивость к антибиотику зеоцину, амплифицировали спомощью ПЦР с праймерами FZeoR и RZeoR по плазмиде pPICZalphaA.
ВекторpJET1.2-PpURE2 обрабатывали рестриктазой BspTI, а получившиеся “липкие”концы достраивали, обрабатывая Pfu-полимеразой. Полученный фрагментплазмиды pJET1.2-PpURE лигировали с последовательностью ZeoR. СтруктуруплазмидыpJET1.2-Ppure2∆ShbleанализировалиспомощьюПЦРисеквенирования (см. Приложения). Общая схема конструирования представленана рисунке 22.83Рисунок22.ОсновныеэтапыконструированияплазмидыpJET1.2-Ppure2∆ZeoR для внесения делеции в последовательность гена PpURE2.Плазмида pJET1.2-Ppure2∆ZeoR была использована в качестве матрицы дляамплификациифрагментаРpure2∆ZeoR,представляющегоизсебяпоследовательность гена устойчивости к зеоцину, фланкированную фрагментамигена PpURE2. Данным ПЦР-продуктом был трансформирован штамм tr2-4-GS115(phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4). Трансформантов отбирали по устойчивости кантибиотику зеоцину.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
