Диссертация (1145914), страница 10
Текст из файла (страница 10)
об/мин. К58осажденным клеткам добавляли 10 мкл ДНК-носителя концентрацией 2 мг/мл(ДНКэритроцитовцыпленка),предварительнопрокипяченного,20мклрестрикционной смеси и 500 мкл PLATE (90 мл 45% PEG4000; 10 мл 1М LiAc; 1мл 1М трис-HCl pH 7,5; 0,2 мл 0,5М ЭДТА). Смесь инкубировали в течение ночипри комнатной температуре, затем клетки высевали на селективную среду.Выделение хромосомной ДНК из дрожжей (Guthrie & Fink, 1991)Клетки дрожжей культивировали в 4 мл среды YPD до оптической плотности(600 нм) = 5. Клеточную суспензию осаждали центрифугированием 3000 об/мин10 минут. Осадок промывали водой и ресуспендировали в 500 мкл буфера (50 мМтрис-HCl рН 7,5, 20 мМ ЭДТА, 1% SDS).
Добавляли 0,6 г стеклянных шариковдиаметром0,45мм,промытыхкислотой.Перемешивали1минутуиинкубировали 1 минуту при 0°С. Цикл повторяли 5 раз. Затем инкубировали 10минут при температуре 70°С. После перемешивания добавляли 200 мкл 5М КАс и150мкл5МNaCl.Инкубировали20минутпритемпературе0°С.Центрифугировали пробирки при 14000 об/мин 20 минут. Отбирали верхнююжидкую фазу. Добавляли 1/3 объёма 30% ПЭГ6000. Инкубировали 10 минут притемпературе 0°С.
Центрифугировали при 14000 об/мин 10 минут. Полученныйосадок хромосомной ДНК растворяли в 20-40 мкл стерильной воды.Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикцииГидролиз ДНК проводили в буферах и при условиях, предложенныхфирмой-изготовителемфермента(ThermoFisherScientificInc,США).Рестрикционную смесь инкубировали 1 час при 37˚С.Первичная культура куриных эмбриональных фибробластов былалюбезнопредоставленасотрудникамиВсероссийскогоНаучно-Исследовательского Ветеринарного Института Птицеводства (г. Ломоносов).Культивирование клеток проводили в среде DMEM с добавлением 10%сыворотки эмбрионов коров.59Секвенирование по СэнгеруСеквенирование проводили с использованием BigDye® Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).
Реакционная смесь объёмом 10 мклсодержала 250 нг плазмидной ДНК, 1,6 мкл праймера для секвенирования (1 мМ),1 мкл BigDye® Terminator v3.1, 1,5 мкл буфера BigDye® Terminator. Реакциюпроводили по следующей программе: 95˚С – 4 минуты, затем 25 циклов: 95˚С – 10секунд, 50˚С – 5 секунд, 60˚С – 2 минуты.Статистическая обработка данныхСтатистическую обработку результатов проводили с помошью программExcel и GraphPad Prism.
Достоверность различий между двумя группами значенийопределяли с помощью U критерия Манна-Уитни.Бионформатический анализГомологов регуляторов S. cerevisiae у P. pastoris искали путем сравненияаминокислотных последовательностей с помощью алгоритма BLAST (Zhang et al.,2000).604. Результаты и обсуждение4.1 Изучение влияния разных типов источников азота и углерода на ростштамма GS115 P. pastorisЭффективность метаболических процессов определяет скорость роста иделения клеток. Чтобы охарактеризовать влияние типа источника азота на ростдрожжей P. pastoris культуры исходного штамма GS115 выращивали в жидкихсредах различного состава. В качестве источников углерода использовалиглицерин и метанол.
В качестве источников азота были выбраны сульфатаммония, глутамин, глутамат, мочевина и пролин. На рисунке 11 представленыкривые роста штамма GS115 P. pastoris в средах различного состава.Как видно, при выращивании штамма GS115 в средах с глицерином (MG) типисточника азота практически не влияет на скорость роста и конечную плотностькультуры. Совсем иная картина наблюдается при выращивании P. pastoris всредах MM с разными источниками азота и метанолом в качестве источникауглерода. В средах, содержащих бедный источник азота пролин, оптическаяплотность культуры примерно в полтора раза выше, чем при использованииглутамина, сульфата аммония или мочевины.
Глутамат при этом занимаетпромежуточное положение.Рост штамма GS115 P. pastoris в средах с глицерином и пролином в качествеисточника азота не отличается от роста в средах метанолом и пролином. Когда жев качестве источников азота использовали сульфат аммония, глутамин илимочевина, то использование глицерина в качестве источника углерода приводит кпочти двукратному увеличению оптической плотности культуры, по сравнениюсо средами с метанолом.В биотехнологии применяются штаммы P.
pastoris, характеризующиесяразличными фенотипами, в зависимости от их способности к утилизацииметанола. Исходный штамм GS115 (his4 AOX1 AOX2) относится к дикому типу Mut+. Делеция гена алкогольоксидазы AOX1 приводит к замедленному росту на61Рисунок 10. Кривые роста штаммов P. pastoris в средах с глицерином (MG) или метанолом (MM). В качествеисточников азота использовали сульфат аммония (NH4+), глутамин (Gln), глутамат (Glu), мочевину (Urea) и пролин (Pro).А – рост штамма GS115 (his4 AOX1 AOX2) в средах с глицерином (MG) и различными источниками азота. B – ростштамма GS115 (his4 AOX1 AOX2) в средах с метанолом (MM) и различными источниками азота.
C – рост штамма 5GS115 (aox1::HIS4 AOX2) в средах с метанолом (MM) и различными источниками азота.62средах с метанолом (фенотип MutS). Такие штаммы чаще всего используются вбиотехнологии, поскольку они меньше окисляют метанол при индукции синтезарекомбинантного белка. Активность алкогольоксидазы сохраняется за счетэкспрессии гена АОХ2.В связи с этим на следующем этапе работы исследовали рост штаммов P.pastoris с фенотипом MutS в средах с метанолом и различными источникамиазота.
Для этого был сконструирован штамм 5-GS115 (aox1::HIS4 АОХ2),несущий делецию гена AOX1 (MutS), у которого активность алкогольоксидазыпроявляется только за счет экспрессии гена AOX2. Исходный штамм GS115 (his4AOX1 AOX2) трансформировали фрагментом плазмиды pPIC9, полученным при еёобработке рестриктазой BglII. При этом происходило замещение гена АОХ1 засчет гомологичной рекомбинации с его промотором и терминатором. В связи стем, что плазмида pPIC9 содержит маркерный ген HIS4, трансформанты отбиралина селективной среде по восстановлению способности синтезировать гистидин.Наличие делеции гена АОХ1 подтверждали с помощью ПЦР и секвенирования(см.
Приложения).Рост штамма 5-GS115 (aox1::HIS4 АОХ2), характеризующегося фенотипомMutS, определяли в жидких средах ММ с метанолом и разными источниками азота(Рис. 10). Кривые роста полученного штамма характеризуются сниженнымизначениями клеточных плотностей в стационарной фазе роста по сравнению сисходным штаммом GS115 (his4 AOX1 AOX2), что связано с уменьшениемактивности алкогольоксидазы. При этом различия в конечных плотностяхклеточных культур в средах с разными источниками азота сохраняются.
В средах,содержащих пролин, конечная плотность культуры примерно в два раза выше,чем при использовании глутамина, сульфата аммония и мочевины. Глутамат, каки в случае исходного штамма GS115, занимает промежуточное положение.Поскольку при делеции гена AOX1, который обеспечивает около 90%алкогольоксидазной активности в клетках P.
pastoris, сохранялись различия вросте штаммов на средах с метанолом и разными источниками азота, можно63предположить, что регуляция генов АОХ1 и АОХ2 зависит от качества источникаазота.4.2 Влияние источников азота на экспрессию генов метаболизмаметанолаПоскольку тип источника азота влиял на рост культур P. pastoris в средах сметанолом, следующим этапом работы стало изучение экспрессии MUT- и PEXгенов. В качестве мишеней были выбраны три группы генов: гены, кодирующиеосновные ферменты пути утилизации метанола (AOX1, AOX2, CAT1, DAK, DAS,FLD, и FGH), гены, отвечающие за биогенез и деградацию пероксисом (PpPEX5 иPpPEX14), а так же гены, кодирующие белки-регуляторы биогенеза пероксисом PpPEX8 и PpPEX1.
Уровни экспрессии исследуемых генов определяли с помощьюПЦР в режиме реального времени.Штамм GS115 выращивали до ранней логарифмической фазы в средах,содержащих метанол, в качестве источника углерода. В качестве источниковазота были выбраны сульфат аммония и пролин, поскольку они показалинаиболее контрастные результаты в экспериментах по росту клеточных культур.На рисунке 12 представлены результаты количественного анализа уровняэкспрессии исследуемых генов относительно уровня экспрессии референсныхгенов АСТ1 и ТВР1 в зависимости от типа источника азота в среде. Показано, чтоиспользование пролина в качестве источника азота существенно снижает уровеньэкспрессии исследуемых генов по сравнению с сульфатом аммония. Полученныерезультаты позволяют предположить, что данная регуляция осуществляется науровне транскрипции.64Рисунок 12.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
