Диссертация (1145914), страница 9
Текст из файла (страница 9)
ОлигонуклеотидыВсе олигонуклеотиды, использованные в работе, приведены в таблице 3.Все зонды для ПЦР в режиме реального времени имели модификацию ROX –BHQ2.Таблица 3.Последовательности олигонуклеотидов и зондов, использованных в работеНазваниеПоследовательностьACT1 F5’-AGTGTTCCCATCGGTCGTAG-3’ACT1 R5’-GGTTCATTGGAGCCTCAGTC-3’TBP F5’-CACGCAAGAAACGCTGAATA -3’TBP R5’-AAGGCCAAACCTTCCAATCT-3’DAS F5’-TACGGATGGGAGAGATACGC-3’DAS R5’-GTGCTTTGGTTTTCCCTTCA-3’50DAK F5’-TGCCCCAGAAATAGACGAAG-3’DAK R5’-TTCACCACAATCACCATCTCC-3’PpPEX5 F5’-CGGAGGAGGCAGTAGAGG-3’PpPEX5 R5’-AAATGCTCTCTTTAGGGTCTCG-3’FLD F5’-GAATCTTGCCACAAGGGTTG-3’FLD R5’-TGCTTTGTTGATGTTGTCCAG-3’ACT1 зонд5’-CACCACACCTTCTACAACGAGTTGCGT-3’TBP зонд5’-TGGTTGTCACTGGTGCTAAGTCCGAGG-3’DAS зонд5’-GAGAAGATTGGTGAGAAGGTTGCTG-3’DAK зонд5’-TATGCTGACCTTCTGGAGTCTGGT-3’PpPEX5 зонд5’-GGGCAGATATAAAGAGGCTGTTGAAC-3’FLD зонд5’-ATCTCTACCCGTCCTTTCCAGTTGG-3’PHO5F5’- CGGGATCCCGAGATTACCAA-3’PHO5R5’- CGGAATTCCAAAACTATTGT-3’RPHO55’-ACTAGTCTGGTCAAAGAAAGCAC-3’FAOX15’-TGTACATGGTATTGTTTGTATGGAGG-3’PAOX2F5’-TTCGACGTCCTGCCCTCTCC-3’PAOX2R5’-TTCGGATCCTTTTCTCAGTTGATTTG-3’PAOXFlaF5’-ACCTGACGTCTAAGAAACCAT-3’PAOXFlaR5’-GCGCGGATCCTTCGAATAATT-3’delAF5’-AACGCAAATAGCCTAACG-3’delAR5’-TTAGGCTATTTGCGTTTCG-3’delBF5’-GGAATACTGTTCTAACC-3’delBR5’-GAACAGTATTCCCAC-3’delCF5’-GCCTAACGACAACTTGAG-3’delCR5’-AAGTTGTCGTTAGGCTATCAG-3’delDR5’-GGATCCAGTCGC-3’PKRF5’- TTGGTGACTTTGGTCTCGTG-3’PKRR5’-TCGCTTGGTGAAGTTCAGTG-3’51OASLF5’- GCGTCAGCGATGTCTGCOASLR5’- TTCACCAGGACCTCCATCTCMX1F5’- TGCTTTTGGATGTGCTTCAC-3’MX1R5’- TTGGTAGGCTTTGTTGAGGTG-3’GAPDHF5’- GAGGGTAGTGAAGGCTGCTG-3’GAPDHR5’- ACCATCAAGTCCACAACACG-3’OASL зонд5’- GAGATAGAGAAGGAGTGGTGCATCC-3’PKR зонд5’- CTGGGATTGATTTGGTTTGAAATTCTTTC-3’MX1R зонд5’- CTGGAGCAAGTAAACGCCTGAGC-3’GAPDH зонд5’- GGATACACAGAGGACCAGGTTGTCTC-3’ZeoF5’- CCCACACACCATAGCTT-3’ZeoR5’- GATCTCATGACCAAAAT-3’FPpURE25’-CAACCTCTCGGCAGGTTTAC-3’RPpURE25’-ACGTAGGGCTCTAACAAC-3’523.5.
МетодыКачественное определение активности кислой фосфатазы (Самсонова идр., 1975)Качественное определение активности КФ у дрожжей P. pastoris проводилипо стандартной методике, разработанной ранее (Самсонова и др., 1975). Наповерхность среды с выросшими колониями дрожжей накладывали бумажныефильтры, смоченные раствором субстрата α-нафтилфосфата и красителя синегопрочного Б в концентрациях 2 мг на мл 0,1М цитратного буфера рН 4,6. Через 1015 минут оценивали интенсивность окрашивания колоний дрожжей.Количественное определение активности КФ (Падкина и др., 1974)При количественном определении активности КФ в качестве субстратаиспользовали паранитрофенилфосфат (пНФФ).
Паранитрофенол, образующийся врезультате отщепления КФ фосфатной группы от пНФФ имеет максимумпоглощения при длине волны 410 нм. При измерении активности КФ отбирали100 мкл клеточной суспензии и добавляли в пробирки к 800 мкл 0,1 М Naцитратного буфера рН 4,6. Добавляли субстрат - 100 мкл 0,15М пНФФ.Реакционную смесь перемешивали и инкубировали 20 минут при 30ºС в водянойбане. Реакцию останавливали, добавляя 500 мкл 1М NaOH. Измеряли поглощениесвета растворов при длине волны 410 нм.
Удельную активность кислойфосфатазы определяли как отношение величины поглощения света реакционнойсмесью при длине волны 410 нм к величине оптической плотности исходнойклеточной суспензии при длиневолны 550 нм.Все эксперименты сиспользованием КФ в качестве репортерного гена проводили как минимум вшести повторностях.53Количественное определение активности каталазы (Stern, 1937; Beers etal., 1952)Метод количественного определения активности каталазы основан наспособности данного фермента расщеплять перекись водорода, что фиксируетсякак изменение оптической плотности при длине волны 240 нм.
Клетки дрожжей,помещенные в 0,1 М Na-фосфатный буфер pH 7, разрушали механически втечение 10 минут с использованием шариков баллотини. Затем пробыцентрифугировали 2 минуты на скорости 13,4 тыс. об/мин. Реакционная смесьпредставляла из себя 0,1М Na-фосфатный буфер, который доводили дооптической плотности в пределах 0,520 – 0,550 (λ = 240 нм) добавлением 0,036%перекиси водорода. При измерении активности каталазы в реакционную смесьобъемом 2,9 мл добавляли 0,1 мл супернатанта, полученного при разрушенииклеток. Фиксировали время, за которое оптическая плотность раствора снижаласьот 0,45 до 0,40 (λ = 240 нм), за счёт расщепления перекиси водорода каталазой.Активностьпересчитывали по формуле “единицы активности фермента/мл=[3,45*(кратностьразведения)]/[(секунды)*0.1]”.Удельнуюактивностьрассчитывали исходя из отношения активности каталазы к концентрации белка влизате клеток, измеренной по методу Брэдфорд (Bradford , 1976).
Экспериментыпо определению удельной активности каталазы проводили в шести повторностях.Определение интенсивности флуоресценции белка mRFPШтамм tr4-4-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) с геном, кодирующим mRFP,под контролем промотора АОХ1, проверяли на наличие флуоресценции спомощью микроскопа Leica TCS SP5 (Leica, Германия) в ресурсном центре«Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.Измерение флуоресценции проводили на микропланшетном флуориметре“Synergy2” (BioTek, США). При измерении флуоресценции mRFP использовалидлину волны 580 нм (+/–20) для возбуждения флуоресценции и детектировалифлуоресценцию при длине волны 630 нм (+/–25).
Удельную флуоресценциюmRFP определяли как отношение величины эмиссии света клеточной суспензией54при длине волны 630 нм к величине оптической плотности суспензии при длиневолны 550 нм.Все эксперименты с использованием mRFP в качестверепортерного гена проводили как минимум в шести повторностях.Подсчёт флуоресцирующих клеток дрожжей проводили с использованиемпроточного цитофлуориметра Guava EasyCyte (Millipore, США).Выделение тотальной РНК из дрожжейВыделение тотальной РНК из клеток P. pastoris штамма GS115 проводили спомощью набора GeneJet RNA extraction Kit в буферах и при условиях,предложенных фирмой-производителем (Thermo Fisher Scientific Inc, США).
Прикаждом выделении использовали одинаковые количества клеток – 2*108. Подсчетклеток проводили в камере Горяева с помощью стандартной методики (Захаров идр., 1976).Синтез кДНК методом обратной транскрипцииКомплементарную ДНК для проведения ПЦР в режиме реального времениполучали с помощью набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit приусловиях, предложенных фирмой-производителем (Thermo Fisher Scientific Inc,США). В качестве матрицы использовали 200 нг тотальной РНК. Синтезпроводили в течение 1 часа при 42 ºС.Полимеразная цепная реакция (ПЦР)В состав каждой пробы объемом 50 мкл, входили: 0,3 мкл плазмиды (1 нг)или 3 мкл хромосомной ДНК (1 нг), 10х буфер для ПЦР 5 мкл, 2мМ раствордезоксирибонуклеотидов 5 мкл, по 0,2 мкл (20 пмоль) прямого и обратногопраймеров, 10x раствор РНКазы 5 мкл (в случае ПЦР с хромосомной ДНК), 0,2мкл полимеразы Taq (5 ед/мкл) или 0,5 мкл полимеразы Pfu (2,5 ед/мкл) взависимости от синтезируемого размера фрагмента, вода до 50 мкл.55ПЦР в режиме реального времениВ состав каждой пробы, объемом 50 мкл, входили: 2 мкл кДНК, 10х буфердля ПЦР – 5 мкл, 2мМ раствор дезоксирибонуклеотидов – 5 мкл, по 0,2 мкл (20пкмоль) прямого и обратного праймеров, 0,2 мкл (20 пкмоль) зонда, 37,2 мклводы, 0,2 мкл полимеразы Taq (5 ед/мкл).
Реакцию проводили при помощиамплификатора нуклеиновых кислот АНК-32 (“Синтол”, Россия) по следующейсхеме: 3 минуты при 95 ºС, затем 50 циклов, включающих 30 секунд при 95 ºC и40 секунд при 60 ºC. Температура отжига всех праймеров составляла 60 ºC.Праймеры для ПЦР в реальномвремениподбирали с использованиемпрограммы “Primer 3” (http://primer3.sourceforge.net/). Для всех исследуемых геновреакция проводилась в как минимум в трех повторностях с каждым изреференсных генов. Для проведения относительной количественной оценкиуровней экспрессии генов применяли ΔΔCt метод, согласно которому Ct генаинтереса в тестируемых пробах оценивали относительно Ct гена-нормализатора(Ермилова и др., 2011). Результирующие значения для одного из условийпринимали за 100% и значения для других условий сравнивали с даннымуровнем.Электрофорез фрагментов ДНК (Остерман, 2002)Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 0,8% агарозном геле в буфере ТАЕ(40 мМ трис-НС1, 40 мМ ледяная уксусная кислота, 0,3,М ЭДТА рН 8.0).
Дляокрашивания препаратов ДНК добавляли 8 мкл раствора бромистого этидия на 100мл раствора. Электрофорез проводили при напряжённости поля 6-7 В/см.Выделение фрагментов ДНК из агарозного геляВыделение проводили набором Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (ThermoFisher Scientific Inc, США) с помощью реактивов и по рекомендациям,предложенным фирмой-производителем.56Концентрирование раствора ДНК (Маниатис и др., 1984)К пробе ДНК добавлялся 3М ацетат натрия рН 5,2 (1/15 от объема пробы) и96% этанол (2 объема пробы с учетом добавленного ацетата натрия). Осаждениепроводили при -20 ºС (в течение ночи) или при -70 ºС (в течение 20 минут), далеепробу центрифугировали 15 мин при скорости 13 тыс. об/мин.
Осадок промывали70%этанолом,высушивалиирастворяливнебольшомколичестведеионизированной воды.Дефосфорилирование фрагментов ДНКДефосфорилирование проводили с помощью набора FastAP (Thermo FisherScientific Inc, США). 1 мкг растворенной ДНК смешивали с 10X буфером и 1 ед.фосфатазы.Суммарныйобъемсмесисоставлял20мкл.Реакциюдефосфорилирования проводили при условиях, рекомендованных фирмойпроизводителем.Лигирование фрагментов ДНКЛигирование проводили в объеме 20 мкл. К смеси фрагментов ДНК,суммарной массой 200 нг, добавляли 2 мкл 10Х буфера, 1ед. лигазы Т4 (ThermoFisher Scientific Inc, США).
Реакцию проводили в течение ночи при при 4 ºС.Трансформация бактериальных клеток (Hanahan, 1983)К 100 мкл компетентных клеток добавляли 10 мкл лигазной смеси (100 нгДНК), после этого клетки со смесью инкубировали 30 минут при 0 ºС. Затемклетки подвергали тепловому шоку в течение 30 секунд при 42 ºС в водяной бане.Для остановки теплового шока клетки помещали в ледяную баню на 15 сек.Клетки растили 1 ч в 900 мкл жидкой LB, а затем высеивали на среду сантибиотиком.57Приготовление компетентных клеток (Hanahan, 1983)Для приготовления компетентных клеток 1 мл стационарной культуры E. сoliзасевали в 100 мл свежей среды TYM и выращивали в качалке при комнатнойтемпературе до оптической плотности клеточной суспензии OD (550нм) = 0,4.Центрифугировали клетки при 5000 оборотов в минуту (об/мин) в течение 10минут.
Осадок ресуспендировали в 2 мл охлаждённого буфера TfB1 (15%глицерола, 10мМ СаСl2, 100мМ KCl, 30мМ KAc, 50мМ MnCl2). Клетки в буфереинкубировали 40 минут в ледяной бане. Затем клетки центрифугировали при 5000об/мин 15 минут. Осадок ресуспендировали в 2 мл охлаждённого буфера TfB2(15% глицерола, 10мМ СаСl2, 10мМ KCl, 10мМ MOPS). Разливали суспензиюклеток по 100 и 200 мкл в пробирки ёмкостью 1,5 мл. Пробирки хранили при 70ºС.Электрофорез бактериальных лизатов «Крэк» (Barnes, 1977)В 7,5 мкл воды ресуспендировали колонию бактерий. Затем добавляли 7,5мкл свежего TENS-буфера (0,1M NaOH, 1% SDS, 10мM ЭДТА, 10% глицерин),краситель (0,25% бромфеноловый синий; 0,25% ксилоцианол; 30% глицерин).Полученнуюсмесьпомещаливячейкиагарозногогеляипроводилиэлектрофорез.Выделение плазмид из клеток бактерийПлазмиды из бактерий выделяли с помощью наборов GeneJet PlasmidMiniprep Kit (Thermo Fisher Scientific Inc, США) и GeneJet Plasmid Midiprep Kit(ThermoFisherScientificInc,США)попротоколамисрастворами,предложенными фирмой – производителем.
Качество выделенных плазмидпроверяли с помощью агарозного гель-электрофореза и спектрофотометрии.Трансформация дрожжей (Kaiser et al., 1994, Eible, 1992)Для трансформации использовали ночную культуру дрожжей, выращенную в15 мл YPD. Аликвоту в 50 мкл клеток откручивали 2 мин при 6 тыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
