Диссертация (1145914), страница 5
Текст из файла (страница 5)
pastoris составляет 50-75%. Причём основнымэтапом является получение штаммов, синтезирующих целевой белок на любом,даже самом минимальном уровне, поскольку использование P. рastorisпредоставляет широкие возможности для дальнейшей оптимизации условийкультивирования (Cregg & Cereghino , 2000). Во множестве работ с помощью P.рastoris были достигнуты уровни синтеза целевых белков ≥1 г/л, что являетсяочень хорошим показателем. При этом существуют примеры успешного синтезавнутриклеточных белков в количествах до 22 г/л (Hasslacher et al., 1997), асекреторных белков – до 15 г/л (Werten et al., 1999).
Так же существует рядпримеров успешного синтеза белков с помощью P. рastoris, которые ранее неудавалось синтезировать с помощью других систем на основе Baculovirus или S.cerevisiae (Cereghino et al., 2001b; Cereghino et al., 2002). Однако, несмотря наогромную практическую значимость P. рastoris как объекта биотехнологии,генетический контроль метаболизма основных биогенных элементов у этихдрожжей изучен слабо.Путь утилизации метанола сходен у всех видов метилотрофных дрожжей.Условно его можно разделить на три части: 1) первые реакции, проходящие впероксисомахиприводящиекобразованиюформальдегида;2)путьдиссимиляции, который служит источником энергии для клетки; и 3) путь26ассимиляции, приводящий к синтезу новых трехуглеродных молекул (Unrean,2013) (Рис.
5).Рисунок 5. Путь утилизации метанола у метилотрофных дрожжей (поHartner & Glieder, 2006). На схеме обозначены: Aox – алкогольоксидаза; Cat –каталаза; Fld – формальдегиддегидрогеназа; Fgh – S-формилглутатионгидролаза;Fdh–форматдегидрогеназа;Mfs–метилформатсинтаза;Das–дигидроксиацетонсинтаза; Dak – дигидроксиацетонкиназа; Fba – фруктозо-1,6бисфосфатаза; Tpi – триозофосфатизомераза; DHA – дигидроксиацетон; GAP –глицеральдегид-3-фосфат; DHAP – дигидроксиацетонфосфат; F1,6BP – фруктозо1,6-бисфосфат; F6P – фруктозо-6-фосфат; Pi – фосфат; Xu5P – ксилулозо-5-27фосфат; GSH – глутатион; PYR – пируват; PPP – пентозофосфатный шунт; TCA– цикл трикарбоновых кислот.На первом этапе происходит окисление метанола до формальдегида.
Этареакция осуществляется специальным ферментом – алкогольоксидазой (Aox),которая использует кислород в качестве акцептора электронов. Перекисьводорода, которая является побочным продуктом данной реакции, разлагаетсядругим ферментом – каталазой (Cat), обладающей пероксидазной и каталазнойактивностями. Поскольку перекись водорода необычайно токсична для живыхклеток, первые реакции окисления метанола проходят внутри специальныхорганелл – пероксисом (Veenhuis et al., 1983; Roggenkamp et al., 1975).Часть формальдегида, образующегося в ходе первых реакций окисленияметанола, используется клетками для получения энергии. В этом процессепринимают участие две НАД+-зависимые дегидрогеназы локализующиеся вцитоплазме.
Формальдегид вступает в реакцию с восстановленным глутатионом.ОбразующийсяприэтомформальдегиддегидрогеназойS-гидроксиметилглутатион(Fld)доокисляетсяS-формилглутатиона.S-формилглутатионгидролаза (Fgh) осуществляет его дальнейший гидролиз домуравьиной кислоты и глутатиона, который может снова включиться в циклреакции.Форматдегидрогеназа(Fdh)окисляетмуравьинуюкислотудоуглекислого газа. В ходе реакций, катализируемых дегидрогеназами, на однуисходную молекулу формальдегида синтезируется две молекулы НАД·H.
То, чтоэтот процесс происходит в цитоплазме, сказывается на его энергетическомвыходе. При клеточном дыхании окисление 1 моль НАД·H теоретически даёт 3моль АТФ. Однако при окислении метанола этот процесс не столь эффективен ина 1 моль НАД·H дрожжи синтезируют только 2 моль АТФ (Veenhuis et al., 1983).Другая часть формальдегида включается в цепь реакций ассимиляции.Ключевую роль в этих процессах играет третий пероксисомальный фермент дигидроксиацетонсинтаза (Dhas), которая катализирует транскетолазную реакциюмежду формальдегидом и ксилулозо-5-фосфатом (Douma et al., 1985; Goodman,281985).Образующиесятрёхуглеродныемолекулыдигидроксиацетонаиглицеральдегид-3-фосфата покидают пероксисомы и направляются в цитоплазму(VanDijkenetal.,1978).Дигидроксиацетонфосфорилируетсядигидроксиацетонкиназой (Dak) (Luers et al., 1998).
В последующей альдолазнойреакциимеждуобразуетсядигидроксиацетонфосфатомфруктозо-1,6-бисфосфат,икоторыйглицеральдегид-3-фосфатомдалеедефосфорилируетсяфосфатазой. Образующийся фруктозо-6-фосфат вступает в цикл регенерацииксилулозо-5-фосфата,транскетолазных,представляющийэпимеразныхиизсебяизомеразныхсериютрансальдолазных,реакций.Накаждые3прохождения этого цикла из трёх исходных молекул метанола синтезируется однановая молекула глицеральдегид-3-фосфата (Veenhuis et al., 1983).В клетках метилотрофных дрожжей количества формальдегида, которыебудут направлены на окисление или на биосинтез очень строго регулируются.Регенерация ксилулозо-5-фосфата требует больших затрат АТФ, поэтому приголодании в клетках включаются регуляторные механизмы, обеспечивающиепреимущественное окисление формальдегида для генерации энергии. Этообеспечивается в первую очередь за счёт регуляции транспортаксилулозо-5-фосфата и ограничения его доступности для дигидроксиацетонсинтазы (Rose &Harrison, 1989).Часть глицеральдегид-3-фосфата, образующегося в процессе метаболизмаметанола, используется клеткой для синтеза биомассы.
Другая часть может бытьрасщеплена с выделением энергии, причём ключевую роль в этом процессеиграют митохондрии (Рис.5) (Hartner & Glieder, 2006). Таким образом, при ростена средах с метанолом в клетках P. pastoris активность пероксисом имитохондрий жизненно необходима для роста клеток. Скорее всего, этиорганеллывзаимодействуют не только за счёт общих метаболитов, но икоординировано регулируются клеткой в ответ на изменение состава среды.Однако изучать подобную регуляцию с помощью классических генетическихметодов представляется затруднительным, поскольку дрожжи P. pastorisявляются облигатными аэробами и не могут существовать без митохондрий.29Поэтому особый интерес вызывает поиск факторов среды, которые одновременновоздействуют на эти клеточные органеллы, но при этом не полностьюингибируют их активность.Алкогольоксидаза, катализирующая первую реакцию пути утилизацииметанола, относится к семейству глюкозометанол-холиноксиредуктаз.
У дрожжейP. pastoris она функционирует в виде мультимера, состоящего из восьмисубъединиц с молекулярной массой около 74 кДа. С каждой из субъединиц вкачестве кофактора связана молекула флавинадениндинуклеотида (ФАД) (Van derKlei et al., 1991). Алкогольоксидаза имеет малое сродство к кислороду, поэтомуклеткам дрожжей для компенсации низкой активности фермента приходитсянакапливать его в больших количествах (Couderc & Baratti, 1980). Синтезалкогольоксидазы, как и большинства других белков пероксисом происходит вцитоплазме, после чего она в видеотдельных субъединиц транспортируетсявнутрь пероксисом (Roa & Blobel, 1983).
В матриксе пероксисом поисходитсборка активных гомооктамеров (Goodman et al., 1984), которые затем формируюткристаллоподобные структуры, придающие этим органеллам характернуюкубическую форму (Van der Klei et al., 1991).Структура алкогольоксидазы у P. pastoris кодируется двумя гомологичнымигенами AOX1 и AOX2 (Ellis et al., 1985).
Последовательности этих генов иаминокислотные последовательности кодируемых ими белков сходны более чемна 90% (Koutz et al., 1989). Продукт гена AOX1 обеспечивает большую частьалкогольоксидазной активности – клетки, мутантные по этому гену, практическине растут на среде с метанолом в качестве единственного источника углерода.Различия в уровнях экспрессии генов AOX1 и AOX2 обусловлены разнымиактивностями их промоторов: кодирующая последовательность гена AOX2,помещённая под контроль 5’-регуляторной области гена AOX1 у штаммов сделецией гена AOX1, полностью восстанавливала активность алкогольоксидазыпри индукции метанолом.
И наоборот, штаммы содержавшие кодирующуюпоследовательность гена AOX1 под контролем промотора гена AOX2, имелифенотип сходный с фенотипом штаммов с делецией гена AOX1 – замедленный30рост на среде с метанолом (Cregg et al., 1989). Исходя из наличия двух генов,кодирующих структуру алкогольоксидазы, у дрожжей P. pastoris выделяют трифенотипа по скорости роста на среде с метанолом. У штаммов Mut+ активны обагена (дикий тип). Muts - штаммы содержат делецию или замену гена AOX1 ихарактеризуются замедленным ростом. Mut- - штаммы, содержащие делеции вобоих генах, не способны расти на средах с метанолом. При синтезерекомбинантных белков чаще всего используются Muts штаммы, поскольку,несмотря на замедленный рост на среде с метанолом по сравнению с Mut+штаммами, они дают больший выход продукта и при их использовании требуетсяменьшие количества метанола для индукции синтеза белка (Cregg et al., 1985).Физиологическая роль гена AOX2 у P.
pastoris остаётся неизвестной. Утаких видов метилотрофных дрожжей как H. polymorpha и C. boidinii имеетсялишь по одному гену, кодирующему структуру алкогольоксидазы - гены MOX1 иAOD1, соответственно. Для дрожжей Pichia methanolica, у которых, так же как и уP. pastoris, активность алкогольоксидазы обеспечивается работой двух генов –MOD1 и MOD2, было показано, что нормальная работа гена MOD2 дает клеткамдрожжей селективное преимущество на средах с высокими концентрациямиметанола.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
