Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1145914), страница 2

Файл №1145914 Диссертация (Генетический контроль регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pastoris) 2 страницаДиссертация (1145914) страница 22019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Изучить влияние ингибиторов циклинзависимых и Tor-киназ на экспрессиюгена АОХ1.Научная новизна диссертационной работы. Впервые для дрожжей P.pastoris исследована регуляция экспрессии генов метаболизма метанола, а так жегенов, вовлечённых в функционирование пероксисом, в ответ на изменениеразличных факторов среды – типа источника азота и концентрации фосфата.Впервые в составе промотора гена AOX1 выявлены участки, вовлечённые в егоазотную и фосфатную регуляцию. Продемонстрировано, что ингибитор Тоrкиназногокомплексарапамициниингибиторциклин-зависимыхкиназфлавопиридол, влияют на уровень экспрессии гена алкогольоксидазы I,кодирующего ключевой фермент метаболизма метанола.

В ходе работы созданытестерные штаммы P. pastoris, с помощью которых была проведена оптимизацияусловийкультивированияметилотрофныхдрожжей–продуцентоврекомбинантных белков.Основные положения, выносимые на защиту. 1. Гены метаболизмаметанола и гены, вовлеченные в функционирование и биогенез пероксисом,представляют собой регулон и координированно отвечают на изменениеисточника азота и концентрации ортофосфата в среде.

2. В регуляции экспрессиигена алкогольоксидазы АОХ1 принимают участие TOR-киназы и киназы,ингибируемые флавопиридолом.Апробация работы. Основные результаты диссертационной работыпредставлены в виде четырёх статей, опубликованных в ведущих журналах,рекомендованных ВАК, а так же в виде устных и стендовых докладов наследующих конференциях: на V съезде ВОГиС (Москва, Россия, 2009г.), на 14-й9Пущинской международной школе-конференции молодых ученых “Биология –наука ХХI века” (Пущино, Россия, 2010 г.), на VI Всероссийской конференциимолодых учёных “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающейсредой” (Саратов, Россия, 2012 г.), на III и VI Всероссийских форумах студентов,аспирантов и молодых ученых “Наука и инновации в технических университетах”(Санкт-Петербург, 2009 и 2012 г.), на V Международной школе молодых ученыхпо молекулярной генетике “Непостоянство генома” (Звенигород, Россия, 2012 г.),на III Международной научной интернет-конференции “Биотехнология.

Взгляд вбудущее” (2014 г.), на Международной научно-практической конференции“Актуальные вопросы современных математических и естественных наук”(Екатеринбург, Россия, 2015 г.), Международном симпозиуме “VII Symposium onApplied Microbiology” (Сан-Паулу, Бразилия, 2015 г.). Работа выполнялась приподдержке грантов ИАС 3.37.222.2015 и 0.37.235.2015.Внедрение результатов работы.

С использованием полученных данных, атак же с помощью созданных тестерных штаммов были оптимизированы среды иусловия культивирования метилотрофных дрожжей P. pastoris.Объём и структура диссертации. Текст диссертации состоит изследующих разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”,“Результаты и обсуждение”, “Заключение”, “Выводы”, ”Список используемыхсокращений”, “Список цитируемой литературы” и “Приложения”. Диссертацияпредставлена на 141 странице и содержит 46 рисунков и 8 таблиц.

В “Спискецитируемой литературы” представлены 176 источников.102. Обзор литературыГенетический контроль метаболизма азота и углерода у дрожжей2.1. Метаболизм азота у дрожжей и механизмы его регуляцииМетаболизм азота у дрожжей S. cerevisiae. Адаптация микроорганизмов кизменениюусловийсредыпроисходит,взначительнойстепени,натранскрипционном уровне. При этом гены, кодирующие ключевые ферментыметаболических путей, как правило, способны изменять уровень экспрессии вответ на дефицит нескольких биогенных элементов.

Азот – важный компонентклеточных макромолекул, выполняющих центральные функции в живыхсистемах. В связи с этим прокариотические и эукариотические организмывыработали сложные механизмы для обеспечения клеток азотом.Грибы могут использовать самые разнообразные соединения в качествеисточников азота и синтезируют множество ферментов для разных путейассимиляции и биосинтеза азотсодержащих веществ. Ряд соединений азотаявляется более предпочтительными для использования грибами.Лучше всего азотный метаболизм и его регуляция изучены у дрожжей S.cerevisiae. Центральный путь азотного метаболизма (Рис. 1) у этих дрожжейвключает реакции превращения и биосинтеза глутамата (Glu) и глутамина (Gln) сучастием солей аммония (NH4+).

Глутаминсинтетаза (продукт гена GLN1)катализирует реакцию образования глутамина из глутамата и аммония. НАДФ·Hзависимая глутаматдегидрогеназа (GDH1) контролирует синтез глутамата изаммония и -кетоглутарата, который поступает из цикла трикарбоновых кислот.НАД+-зависимаядегидрогеназа(GDH2)запускаетобратнуюреакциюсобразованием аммония и необходима для роста на среде с глутаматом в качествеединственного источника азота. Важную роль играет продукт гена GAP1 основная пермеаза аминокислот дрожжей, транспортирующая почти все видыаминокислот внутрь клетки (по Magasanik & Kaiser, 2002). Субстраты для синтеза11глутамата и глутамина поступают из реакций «боковых» путей азотногометаболизма, в ходе которых усваиваются менее предпочтительные источникиазота – мочевина (Urea), пролин (Pro), аргинин (Arg).

Для каждого из них вдрожжевой клетке существует специфический набор катаболических ферментов.Рисунок 1. Центральный путь метаболизма азота у S. cerevisiae. Мочевина,пролин, аргинин, соли аммония, а также промежуточное соединение циклатрикарбоновых кислот – α-кетоглутарат – превращаются в глутамат и глутамин,из которых синтезируются все азотсодержащие компоненты клетки (поMagasanik & Kaiser, 2002). Богатые источники азота – Gln и соли аммония –обозначены зеленым цветом, бедные – Pro, Arg и Urea – красным, а занимающийпромежуточное положение Glu– жёлтым. Цифрами обозначены основныереакции азотного метаболизма и гены ферментов, контролирующих этиреакции: 1 – НАДФ·H-зависимая глутаматдегидрогеназа (продукт гена GDH1), 2–глутаминсинтетаза (GLN1), 3 – НАД+-зависимая дегидрогеназа (GDH2), 4 –глутаматсинтаза(GLT1),5–амидолиазамочевины(DUR1,2),6–12кислородзависимаяпролиноксидазакарбоксилатдегидрогеназу(PUT2),(PUT1),8–7–аргиназапирролин-5-(CAR1),9–орнитинаминотрансфераза (CAR2).Для пролина катаболические ферменты кодируются генами семейства PUT.Ген PUT4 кодирует специфическую пермеазу пролина, которая синтезируетсятолько при отсутствии хороших источников азота в среде.

PUT3 кодируеттранскрипционный фактор, который конститутивно синтезируется в клетке,независимо от наличия пролина. Гены PUT1 и PUT2 кодируют пролиноксидазу ипирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу, соответственно. Пролин не может бытьусвоен дрожжевыми клетками в отсутствие кислорода, так как первый этап егодеградации катализирует O2-зависимая пролиноксидаза Put1p. Так же дрожжимогутиспользоватьвкачествеисточникаазотааргинин,являющийсяпредшественником пролина в цепи катаболитных реакций (Magasanik & Kaiser,2002). Катаболизм аргинина включает гидролиз аргиназой (CAR1) с образованиеммочевины и орнитина, трансаминирование орнитина продуктом гена CAR2 свыходом глутамата и пирролин-5-карбоксилата (P5C), который восстанавливаетсядо пролина НАДФ·H-зависимой P5C-редуктазой, продуктом гена PRO3.

И тольков аэробных условиях, в митохондриях белок Put2 превращает P5C в глутамат(Martin et al., 2003).Специфическиеферментыработаютвкатаболизмемочевиныиаллантоина. Ген DUR3 кодирует мембранный переносчик мочевины. Деградациямочевины до диоксида углерода и аммиака катализируется амидолиазоймочевины, обладающей активностями карбоксилазы и аллофанатгидролазы(продукт гена DUR1,2 ). Транспорт аллантоина через мембрану осуществляетсяпродуктом гена DAL4; ген DAL7 кодирует малатсинтазу аллантоиновогокатаболизма (Cooper et al., 1980).Регуляция азотного метаболизма у дрожжей. Качество источника азота всреде влияет на состояние клетки в целом, и у дрожжей существует сложная13сигнальная система, обеспечивающая координированную регуляцию многихметаболических путей в ответ на смену источника азота. Для лабораторныхштаммов S. cerevisiae, которые в основном являются производными штаммаS288C, наиболее предпочтительным источником азота является глутамин (Gln).Штаммы производные штамма Σ1278b, применяемые при изучении ассимиляцииазота, наравне с глутамином используют и соли аммония (NH4+).

Для дрожжей S.cerevisiae бедными источниками азота являются пролин (Pro), мочевина (Urea),орнитин и аллантоин. Промежуточное положение в этом ряду занимает глутамат(Glu) (Magasanik & Kaiser, 2002). Критерием для классификации источников азотана более и менее предпочтительные является продолжительность стадийклеточного цикла, а так же наличие азотной катаболитной репрессии (NCR –nitrogen catabolite repression), которая заключается в подавлении генов иостановке процессов утилизации бедных источников азота при наличии в средеглутамина или солей аммония (Magasanik, 1992).Вкультурахдрожжейвыращенныхнабедномисточникеазотанаблюдаются процессы автофагии, а так же псевдомицелиальный и инвазивныйрост. При переносе клеток в среду, содержащую глутамин наблюдается активациябиогенеза рибосом и репрессия генов пермеаз различных аминокислот.

Приотсутствии источника азота в среде гаплоидные клетки дрожжей переходят всостояние покоя, а диплоидные клетки претерпевают мейоз и споруляцию (Beeser& Cooper, 2000). Перенос клеток со среды с бедным источником азота на среды сглутамином или солями аммония приводит к изменениям в транскрипциимножества генов (Magasanik, 1992).У дрожжей S. cerevisiae экспрессия более 90 генов азотного метаболизмарегулируется системой, основу которой составляют четыре транскрипционныхфактора относящихся к семейству факторов GATA-типа (Marzluf, 1997). Два изних - Gln3p и Gat1p являются активаторами, а другие два – Dal80p и Gzf3pрепрессорами.

Азотная катаболитная репрессия осуществляется в основном засчёт изменения внутриклеточной локализации активаторов транскрипции. Приросте на среде с бедным источником азота Gln3p и Gat1p локализуются в ядре, где14они связаны с GATA-последовательностями внутри промоторов регулируемыхгенов, тогда как при росте на среде с глутамином или солями аммония обатранскрипционных фактора остаются в цитоплазме. Gln3p является активаторомтранскрипции генов GАТ1 и DAL80, что обеспечивает положительную иотрицательную обратную связь при регуляции индукции генов азотногометаболизма (Coffman et al., 1997; Cunningham & Cooper, 1991).

Характеристики

Тип файла
PDF-файл
Размер
3,48 Mb
Предмет
Высшее учебное заведение

Список файлов диссертации

Генетический контроль регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pastoris
Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6390
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее