Диссертация (1145914), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Изучить влияние ингибиторов циклинзависимых и Tor-киназ на экспрессиюгена АОХ1.Научная новизна диссертационной работы. Впервые для дрожжей P.pastoris исследована регуляция экспрессии генов метаболизма метанола, а так жегенов, вовлечённых в функционирование пероксисом, в ответ на изменениеразличных факторов среды – типа источника азота и концентрации фосфата.Впервые в составе промотора гена AOX1 выявлены участки, вовлечённые в егоазотную и фосфатную регуляцию. Продемонстрировано, что ингибитор Тоrкиназногокомплексарапамициниингибиторциклин-зависимыхкиназфлавопиридол, влияют на уровень экспрессии гена алкогольоксидазы I,кодирующего ключевой фермент метаболизма метанола.
В ходе работы созданытестерные штаммы P. pastoris, с помощью которых была проведена оптимизацияусловийкультивированияметилотрофныхдрожжей–продуцентоврекомбинантных белков.Основные положения, выносимые на защиту. 1. Гены метаболизмаметанола и гены, вовлеченные в функционирование и биогенез пероксисом,представляют собой регулон и координированно отвечают на изменениеисточника азота и концентрации ортофосфата в среде.
2. В регуляции экспрессиигена алкогольоксидазы АОХ1 принимают участие TOR-киназы и киназы,ингибируемые флавопиридолом.Апробация работы. Основные результаты диссертационной работыпредставлены в виде четырёх статей, опубликованных в ведущих журналах,рекомендованных ВАК, а так же в виде устных и стендовых докладов наследующих конференциях: на V съезде ВОГиС (Москва, Россия, 2009г.), на 14-й9Пущинской международной школе-конференции молодых ученых “Биология –наука ХХI века” (Пущино, Россия, 2010 г.), на VI Всероссийской конференциимолодых учёных “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающейсредой” (Саратов, Россия, 2012 г.), на III и VI Всероссийских форумах студентов,аспирантов и молодых ученых “Наука и инновации в технических университетах”(Санкт-Петербург, 2009 и 2012 г.), на V Международной школе молодых ученыхпо молекулярной генетике “Непостоянство генома” (Звенигород, Россия, 2012 г.),на III Международной научной интернет-конференции “Биотехнология.
Взгляд вбудущее” (2014 г.), на Международной научно-практической конференции“Актуальные вопросы современных математических и естественных наук”(Екатеринбург, Россия, 2015 г.), Международном симпозиуме “VII Symposium onApplied Microbiology” (Сан-Паулу, Бразилия, 2015 г.). Работа выполнялась приподдержке грантов ИАС 3.37.222.2015 и 0.37.235.2015.Внедрение результатов работы.
С использованием полученных данных, атак же с помощью созданных тестерных штаммов были оптимизированы среды иусловия культивирования метилотрофных дрожжей P. pastoris.Объём и структура диссертации. Текст диссертации состоит изследующих разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”,“Результаты и обсуждение”, “Заключение”, “Выводы”, ”Список используемыхсокращений”, “Список цитируемой литературы” и “Приложения”. Диссертацияпредставлена на 141 странице и содержит 46 рисунков и 8 таблиц.
В “Спискецитируемой литературы” представлены 176 источников.102. Обзор литературыГенетический контроль метаболизма азота и углерода у дрожжей2.1. Метаболизм азота у дрожжей и механизмы его регуляцииМетаболизм азота у дрожжей S. cerevisiae. Адаптация микроорганизмов кизменениюусловийсредыпроисходит,взначительнойстепени,натранскрипционном уровне. При этом гены, кодирующие ключевые ферментыметаболических путей, как правило, способны изменять уровень экспрессии вответ на дефицит нескольких биогенных элементов.
Азот – важный компонентклеточных макромолекул, выполняющих центральные функции в живыхсистемах. В связи с этим прокариотические и эукариотические организмывыработали сложные механизмы для обеспечения клеток азотом.Грибы могут использовать самые разнообразные соединения в качествеисточников азота и синтезируют множество ферментов для разных путейассимиляции и биосинтеза азотсодержащих веществ. Ряд соединений азотаявляется более предпочтительными для использования грибами.Лучше всего азотный метаболизм и его регуляция изучены у дрожжей S.cerevisiae. Центральный путь азотного метаболизма (Рис. 1) у этих дрожжейвключает реакции превращения и биосинтеза глутамата (Glu) и глутамина (Gln) сучастием солей аммония (NH4+).
Глутаминсинтетаза (продукт гена GLN1)катализирует реакцию образования глутамина из глутамата и аммония. НАДФ·Hзависимая глутаматдегидрогеназа (GDH1) контролирует синтез глутамата изаммония и -кетоглутарата, который поступает из цикла трикарбоновых кислот.НАД+-зависимаядегидрогеназа(GDH2)запускаетобратнуюреакциюсобразованием аммония и необходима для роста на среде с глутаматом в качествеединственного источника азота. Важную роль играет продукт гена GAP1 основная пермеаза аминокислот дрожжей, транспортирующая почти все видыаминокислот внутрь клетки (по Magasanik & Kaiser, 2002). Субстраты для синтеза11глутамата и глутамина поступают из реакций «боковых» путей азотногометаболизма, в ходе которых усваиваются менее предпочтительные источникиазота – мочевина (Urea), пролин (Pro), аргинин (Arg).
Для каждого из них вдрожжевой клетке существует специфический набор катаболических ферментов.Рисунок 1. Центральный путь метаболизма азота у S. cerevisiae. Мочевина,пролин, аргинин, соли аммония, а также промежуточное соединение циклатрикарбоновых кислот – α-кетоглутарат – превращаются в глутамат и глутамин,из которых синтезируются все азотсодержащие компоненты клетки (поMagasanik & Kaiser, 2002). Богатые источники азота – Gln и соли аммония –обозначены зеленым цветом, бедные – Pro, Arg и Urea – красным, а занимающийпромежуточное положение Glu– жёлтым. Цифрами обозначены основныереакции азотного метаболизма и гены ферментов, контролирующих этиреакции: 1 – НАДФ·H-зависимая глутаматдегидрогеназа (продукт гена GDH1), 2–глутаминсинтетаза (GLN1), 3 – НАД+-зависимая дегидрогеназа (GDH2), 4 –глутаматсинтаза(GLT1),5–амидолиазамочевины(DUR1,2),6–12кислородзависимаяпролиноксидазакарбоксилатдегидрогеназу(PUT2),(PUT1),8–7–аргиназапирролин-5-(CAR1),9–орнитинаминотрансфераза (CAR2).Для пролина катаболические ферменты кодируются генами семейства PUT.Ген PUT4 кодирует специфическую пермеазу пролина, которая синтезируетсятолько при отсутствии хороших источников азота в среде.
PUT3 кодируеттранскрипционный фактор, который конститутивно синтезируется в клетке,независимо от наличия пролина. Гены PUT1 и PUT2 кодируют пролиноксидазу ипирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу, соответственно. Пролин не может бытьусвоен дрожжевыми клетками в отсутствие кислорода, так как первый этап егодеградации катализирует O2-зависимая пролиноксидаза Put1p. Так же дрожжимогутиспользоватьвкачествеисточникаазотааргинин,являющийсяпредшественником пролина в цепи катаболитных реакций (Magasanik & Kaiser,2002). Катаболизм аргинина включает гидролиз аргиназой (CAR1) с образованиеммочевины и орнитина, трансаминирование орнитина продуктом гена CAR2 свыходом глутамата и пирролин-5-карбоксилата (P5C), который восстанавливаетсядо пролина НАДФ·H-зависимой P5C-редуктазой, продуктом гена PRO3.
И тольков аэробных условиях, в митохондриях белок Put2 превращает P5C в глутамат(Martin et al., 2003).Специфическиеферментыработаютвкатаболизмемочевиныиаллантоина. Ген DUR3 кодирует мембранный переносчик мочевины. Деградациямочевины до диоксида углерода и аммиака катализируется амидолиазоймочевины, обладающей активностями карбоксилазы и аллофанатгидролазы(продукт гена DUR1,2 ). Транспорт аллантоина через мембрану осуществляетсяпродуктом гена DAL4; ген DAL7 кодирует малатсинтазу аллантоиновогокатаболизма (Cooper et al., 1980).Регуляция азотного метаболизма у дрожжей. Качество источника азота всреде влияет на состояние клетки в целом, и у дрожжей существует сложная13сигнальная система, обеспечивающая координированную регуляцию многихметаболических путей в ответ на смену источника азота. Для лабораторныхштаммов S. cerevisiae, которые в основном являются производными штаммаS288C, наиболее предпочтительным источником азота является глутамин (Gln).Штаммы производные штамма Σ1278b, применяемые при изучении ассимиляцииазота, наравне с глутамином используют и соли аммония (NH4+).
Для дрожжей S.cerevisiae бедными источниками азота являются пролин (Pro), мочевина (Urea),орнитин и аллантоин. Промежуточное положение в этом ряду занимает глутамат(Glu) (Magasanik & Kaiser, 2002). Критерием для классификации источников азотана более и менее предпочтительные является продолжительность стадийклеточного цикла, а так же наличие азотной катаболитной репрессии (NCR –nitrogen catabolite repression), которая заключается в подавлении генов иостановке процессов утилизации бедных источников азота при наличии в средеглутамина или солей аммония (Magasanik, 1992).Вкультурахдрожжейвыращенныхнабедномисточникеазотанаблюдаются процессы автофагии, а так же псевдомицелиальный и инвазивныйрост. При переносе клеток в среду, содержащую глутамин наблюдается активациябиогенеза рибосом и репрессия генов пермеаз различных аминокислот.
Приотсутствии источника азота в среде гаплоидные клетки дрожжей переходят всостояние покоя, а диплоидные клетки претерпевают мейоз и споруляцию (Beeser& Cooper, 2000). Перенос клеток со среды с бедным источником азота на среды сглутамином или солями аммония приводит к изменениям в транскрипциимножества генов (Magasanik, 1992).У дрожжей S. cerevisiae экспрессия более 90 генов азотного метаболизмарегулируется системой, основу которой составляют четыре транскрипционныхфактора относящихся к семейству факторов GATA-типа (Marzluf, 1997). Два изних - Gln3p и Gat1p являются активаторами, а другие два – Dal80p и Gzf3pрепрессорами.
Азотная катаболитная репрессия осуществляется в основном засчёт изменения внутриклеточной локализации активаторов транскрипции. Приросте на среде с бедным источником азота Gln3p и Gat1p локализуются в ядре, где14они связаны с GATA-последовательностями внутри промоторов регулируемыхгенов, тогда как при росте на среде с глутамином или солями аммония обатранскрипционных фактора остаются в цитоплазме. Gln3p является активаторомтранскрипции генов GАТ1 и DAL80, что обеспечивает положительную иотрицательную обратную связь при регуляции индукции генов азотногометаболизма (Coffman et al., 1997; Cunningham & Cooper, 1991).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
