Диссертация (1145914), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Белок Ure2pсвязывает Gln3p, чем определяет его локализацию в цитоплазме клетки. В клеткахдрожжей, несущих мутацию ure2, белок Gln3p локализуется в ядре и азотнаякатаболитная репрессия полностью нарушена. Другой активатор Gat1p при этомостаётся в цитоплазме, что позволяет предположить, что его локализация вцитоплазме обеспечивается наличием другого белка подобного Ure2p (Stanbroughet al., 1995).
Схема взаимной регуляции GATA-факторов представлена на рисунке2.Рисунок 2. Модель регуляции транскрипции генов, подверженных азотнойкатаболитной репрессии (NCR-генов) и взаимодействия GATA-факторов взависимости от типа источника азота в среде. Gln3p и Gat1p являютсятранскрипционными активаторами, Gzf3p и Dal80p – репрессорами (по Coffman etal., 1997).15Дрожжи S. cerevisiae определяют качество источника азота в среде исходяиз внутриклеточной концентрации глутамина и/или глутамата.
Так у мутантов сосниженной активностью гена GLN1, кодирующего глутаминсинтетазу, гены,подверженные азотной катаболитной репрессии, активны при росте клеток насреде с солями аммония, тогда как при использовании глутамина в качествеисточника азота репрессия этих генов сохраняется. Обработка клеток дрожжей,растущих на среде с солями аммония ингибитором глутаминсинтетазысульфоксимином, так же приводит к нарушению азотной катаболитной репрессии(Crespo et al., 2002; Mitchell & Magasanik, 1984). Эти данные позволяютпредположить,чтовзаимодействиеконцентрациябелковGln3pиглутаминавнутриUre2p.Обработкаклеткивлияетклетокнадрожжейсульфоксимином не влияет на локализацию другого активатора Gat1p, чтосогласуется с гипотезой о регуляции его работы в зависимости от концентрацииглутамата внутри клетки (Kulkarni et al., 2006; Magasanik& Kaiser, 2002).
Даннаясистема позволяет клеткам дрожжей осуществлять очень точную регуляциюгенов азотного метаболизма. При снижении внутриклеточной концентрацииглутамина активируется транскрипционный фактор Gln3p и снимается азотнаякатаболитнаярепрессия.Когдажепроисходитснижениеуровнявнутриклеточного глутамата, активируется ТФ Gat1p, что приводит к ещёбольшемуусилениюэкспрессиигенов,обеспечивающихиспользованиеальтернативных источников азота (Kulkarni et al., 2006).Малоизученными остаются молекулярные механизмы, обеспечивающиечувствительностьклеткикконцентрацииглутаминаиглутаматаиконтролирующие локализацию Gln3p и Gat1p внутри клетки. Предложена модель,связывающая внутриклеточные уровни глутамина и глутамата с активностьюбелков Tor, являющихся серин-треониновыми протеинкиназами, входящими всемейство фосфатидилинозитол-3-киназ.
Дрожжи S. cerevisiae обладают двумябелковыми комплексами TORC1 и TORC2, содержащими протеинкиназу Tor(Wullschleger et al., 2006; De Virgilio & Loewith, 2006). У большинстваэукариотических организмов Tor-киназа кодируется одним геном, тогда как S.16cerevisiae обладают двумя различными киназами - Tor1p и Tor2p (Cardenas et al.,1999). Подобная особенность S.
cerevisiae связана с тем, что эти дрожжи впроцессе эволюционного развития претерпели дупликацию генома. КомплексTORC1, куда помимо Tor1p, входят ещё пять различных белков, участвует врегуляции пролиферации клетки, а также обеспечивает переход клетки всостояние покоя при неблагоприятных условиях. Комплекс TORC2 регулируеторганизацию актинового цитоскелета и полярность клетки (Wullschleger et al.,2005).При обработке клеток антибиотиком рапамицином, который нарушаетработукомплексаTORC1,наблюдаютсяэффекты,сходныесазотнымголоданием: автофагия, синтез пермеаз различных аминокислот, а также переходклеток в стадию G0 (Hardwick et al., 1999; Cox et al., 2004).
Помимо этого приобработке рапамицином, также как и при азотном голодании, в клетке изменяетсяэкспрессия нескольких сотен NCR-чувствительных генов (Shamji et al., 2000). Этиданные свидетельствуют о том, что TORC1 является важнейшим участникомсигнального пути, обеспечивающего азотную регуляцию (Lorberg & Hall, 2004).Существуют данные, говорящие о возможности наличия других путейрегуляции генов в ответ на тип источника азота в среде. Во-первых, азотноеголодание является легкообратимым процессом и клеткам необходимо не болеечаса, чтобы вновь перейти к нормальному росту при изменении условий среды. Вто же время для перехода к нормальному росту после обработки рапамициномклетке может потребоваться более длительное время (Dubouloz et al., 2005).
Вовторых, хотя и дефицит азота, и обработка клеток рапамицином приводят кснятию азотной катаболитной репрессии, фосфорилирование Gln3p в ответ на этидва стимула осуществляется по-разному (Cox et al., 2004).Одной из основных мишеней TORC1-киназного комплекса является белокTap42p, который является регулятором фосфатазы 2А (РР2А) и других подобныхей фосфатаз (Di Como & Arndt, 1996; Duvel & Broach, 2004). Фосфатаза 2Афункционируетввидегетеротримера,состоящегоизкаталитическойсубъединицы кодируемой генами PPH21, PPH22, и PPH3, а так же связующей и17регуляторной субъединиц. РР2А-подобная фосфатаза состоит только из двухсубъединиц – каталитической, кодируемой геном SIT4, и регуляторной. ИменноРР2А и подобные ей фосфатазы обеспечивают дефосфорилирование Gln3p, чтоприводит к его перемещению внутрь ядра и снятию азотной катаболитнойрепрессии (Jiang & Broach, 1999) (Рис.
3).Рисунок 3. Модель контроля внутриклеточной локализации Gln3p сучастием комплекса TORC1 в клетках дрожжей (по Conrad et al., 2014). Приналичие богатых источников азота в среде активность Tor-киназного комплексаприводит к ингибированию ряда фосфатаз (PPA2, Sit4p). В результате комплексыUre2p с белками Gln3p и Gat1p оказываются гиперфосфорилированы и неактивны(Ptacek et al., 2005). При азотном голодании или наличии только бедныхисточников азота в среде Tor-киназный комплекс инактивируется, что приводит квысвобождениюTap42p–фосфатазныхкомплексов.Последующеедефосфорилирование белков Ure2p, Gln3p и Gat1p индуцирует транслокациюпоследних в ядро.
Далее транскрипционные активаторыGln3p и Gat1pиндуцируют экспрессию генов, подверженных азотной катаболитной репрессии(NCR – генов).18Количество белка Tap42p в клетке примерно в пять-десять раз меньше, чемкаталитических субъединиц фосфатазы 2А, а значит, он может связаться не болеечем с 20% всех молекул РР2А в клетке. Это опровергло первоначальнопредложенные модели стехиометрической регуляции активности РР2А белкомTap42p. Недавно была предложена новая модель, согласно которой комплексTap42p-РР2А в неактивном состоянии прикрепляется к комплексу TORC1 наповерхности внутриклеточных мембран.
Азотное голодание или обработка клетокрапамицином высвобождает комплекс Tap42p-РР2А в цитоплазму, где онмедленно дефосфорилируется и диссоциирует, что приводит к активации РР2А(Jiang & Broach, 1999; Yan et. al., 2006).Азотная регуляция у метилотрофных дрожжей мало изучена. У H.polymorpha обнаружено несколько генов, вовлечённых в азотную катаболитнуюрепрессию (Rossi et. al., 2005). Ген NMR2 кодирует транскрипционный фактор,сходный по выполняемым функциям с белками NmrA из Aspergillus nidulans,Nmr1р из Neurospora crassa и Ure2p из S. cerevisiae, и участвует в репрессии NCRчувствительных генов. Продукт гена NMR4 является сенсором концентрацииаммония в среде и/или переносит аммоний внутрь клетки.
Мутации в гене NMR1приводят к дерепресии ассимиляции нитратов клетками дрожжей даже приналичии глутамата в среде. Если в среде присутствует глутамин, то гены,отвечающиезаассимиляциюнитратов,умутантовnmr1остаютсярепрессированными, что позволяет предположить наличие различных механизмоврепрессии NCR-чувствительных генов у H. polymorpha. Особый интерес вызываетвзаимодействиепутиутилизацииметанолакакисточникауглеродаиметаболических путей различных источников азота у метилотрофных дрожжей.Для дрожжей H. polymorpha было показано, что существуют независимые пути,регулирующие биогенез и деградацию пероксисом в ответ на качество источникаазота и углерода (Bellu et al., 2001).У дрожжей P. pastoris экспрессия гена, кодирующего структуру ферментаформальдегиддегидрогеназы (Fld), индуцируется не только метанолом в среде вкачестве единственного источника углерода, но и одним из источников азота –19метиламином (Shen et al., 1998).
Это указывает на возможность взаимодействияпутей метаболизма азота и углерода у P. pastoris. Благодаря удобному механизмуиндукцииисточникомазота,промоторгенаFLDиспользуетсядлягетерологичной экспрессии.2.2. Регуляция метаболизма углерода у дрожжей S. cerevisiae и P. pastorisРегуляция метаболизма глюкозы у дрожжей S. cerevisiae. Дрожжи S.cerevisiae способны использовать самые различные типы углеродсодержащихсубстратов. При этом для них предпочтительными источниками углеродаявляются глюкоза и фруктоза. Наличие этих сахаров в среде ингибируетбиосинтез ферментов, обеспечивающих утилизацию других источников углерода(Chi et al., 2004).
Подобное явление получило название глюкозной катаболитнойрепрессии.УдрожжейкодирующиеS.cerevisiaeферменты,глюкознаяобеспечивающиерепрессиязатрагиваетметаболизмрядагены,сахаровинеферментируемых источников углерода, в частности глицерина, этанола иацетата, а также ряда генов, вовлеченных в глюконеогенез и дыхательныепроцессы (Trumbly, 1992).Выделяют несколько уровней регуляции генов, которые подверженыглюкозной репрессии.Регуляцияможет осуществлятьсякакнауровнетранскрипции, за счет изменения концентрации и стабильности соответствующихмРНК, так и на постранскрипционном уровне, за счёт регуляции скороститрансляции и деградации белков (Gancedo, 2008).Основным механизмом регуляции генов при глюкозной катаболитнойрепрессии является регуляция на уровне транскрипции.
Показано, что около 40 %генов дрожжей S. cerevisiae изменяют уровень экспрессии более чем в два разапри добавлении глюкозы к клеткам, растущим на глицерине (Wang et al., 2004).При наличии глюкозы в среде её поступление внутрь клеток обеспечиваетсябелками - транспортерами гексоз (Hxt). Гексокиназы (Hxk) обеспечивают её20фосфорилирование до глюкозо-6-фосфата. При этом наблюдается инактивацияпротеинкиназы Snf1р, что приводит к перемещениюрепрессора Mig1р изцитоплазмы в ядро. Mig1р взаимодействует с белками-репрессорами Tup1 и Ssn6и блокирует транскрипцию генов, подверженных глюкозной катаболитнойрепрессии (Verstrepen et al., 2004).Дефицит глюкозы приводит к активации киназного комплекса Snf1, чтообеспечивает цитоплазматическую локализацию ТФ Mig1р и снятие репресии.(Verstrepen et al., 2004).Схема основных механизмов, обеспечивающих обеспечение глюкознойкатаболитной репрессии у S.
cerevisiae представлена на рисунке 4.Помимо участия в метаболизме глюкозы транспортеры гексоз явлютсяважным звеном в обеспечении глюкозной катаболитной репрессии. Показано, чтостепень репрессии определяется скоростью транспорта глюкозы внутрь клетки(Reifenberger et al., 1997). У S. cerevisiae известно, по меньшей мере, 20 такихтранспортеров (кодируемых генами HXT1—HXT17, GAL2, SNF3 и RGT2)(Wieczorke et al., 1999). Экспрессия этих генов по-разному регулируется в ответна концентрацию глюкозы в среде. Ген HXT1 индуцируется при высокойконцентрации глюкозы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
