Диссертация (1145914), страница 7
Текст из файла (страница 7)
pastoris регулируется так же, как и гомологичный ему промотор гена35MOX1 - не репрессируется при наличии глицерина в среде и проявляет высокийуровень экспрессии даже без индукции метанолом (Hartner & Glieder, 2006).Делеционный анализ промотора гена AOX1 выявил несколько участков,удаление или изменение которых сильно влияло на активность промотора. Былиидентифицированы регуляторные элементы промотора, вовлечённые в егоиндукцию метанолом (Рис. 6).Рисунок 6.
Цис-регуляторные элементы в составе промотора гена АОХ1 (поVogl&Glieder,2013).Представленосхематическоеизображениепоследовательности промотора гена АОХ1, используемой в составе большинствакоммерческих плазмид. На рисунке обозначен ТАТА-box и место инициациитранскрипции (TSS). Трансляция инициируется после нуклеотида, обозначенного+1. Приведены результаты делеционного аназиза промотора, проведенного всерии работ (Xuan et al., 2009 и Lin-Cereghino et al., 2006).
В скобках приведенывыраженные в процентах значения активности промотора с делецией в сравнениис нативным промотором. На самой последовательности промотора отмеченысайты связывания ТФ Mxr1p, обнаруженные в работе Кранти и др. (Kranthi et al.,2010).36Делеционный анализ последовательности промотора гена AOX2 показалналичие в нём трёх цис-регуляторных элементов. Два из них (URS1 и URS2)отвечают за репрессию промотора, а третий (UAS) вовлечён в его индукцию.
Впоследовательности промотора гена AOX1 обнаружен участок, гомологичныйUAS последовательности промотора AOX2, однако какую роль играет этотучасток в регуляции гена пока не известно (Ohi et al., 1994).Ключевым регулятором пути утилизации метанола у P. pastoris являетсябелок Mxr1 (methanol expression regulator 1), гомолог которого обнаружен так же иу H. polymorpha. Роль Mxr1p была подробно изучена у P. pastoris (Lin-Cereghino etal., 2006). Отсутствие Mxr1p приводит к неспособности клеток расти на среде сметанолом и к нарушению образования пероксисом.
Делеция гена MXR1 влияетна экспрессию других генов пути утилизации метанола. Показано, что белокMxr1p имеет большую степень гомологии с упомянутым ранее ТФ Adr1p – однимиз важнейших регуляторов системы β-окисления жирных кислот у дрожжей S.cerevisiae. Эти ТФ сходным образом регулируют гены PEX, вовлечённые вбиогенез пероксисом у дрожжей P. pastoris и S.
cerevisiae. Помимо сходствафункцийэтиТФимеют большуюстепень гомологии аминокислотныхпоследовательностей в обнаруженных у них сайтах фосфорилирования и вучастках, ответственных за связывание промоторов регулируемых ими генов. ДляТФ Adr1p показана способность связываться с участком внутри промотора генаAOX1 P. pastoris, вовлечённым в индукцию этого гена метанолом (Lin-Cereghinoet al., 2006). В промоторе гена AOX1 есть шесть сайтов связывания Mxr1p(MXRE1-6; Kranthi et al., 2009); разные сайты имеют различную эффективностьсвязывания. Так, эффективнее всего Mxr1p взаимодействует с сайтом MXRE1, аменее эффективно – с сайтом MXRE4 (Vogl & Glieder, 2013) (Рис.
7). Помимоэтого сайты связывания регулятора Mxr1 были найдены в промоторах генов DASи PpPEX8 (Kranthi et al., 2010; Lin-Cereghino et al., 2006).Белок Mxr1 присутствует в клетке постоянно, и ранее предполагали, чторегуляцияего активности происходит за счет изменения локализации: вприсутствии глюкозы в среде белок находится в цитоплазме, а при добавлении37метанола транспортируется в ядро (Hartner et al, 2006). Позднее выяснилось, чтоон присутствует в ядре при росте клеток на среде, содержащей глицерин илиэтанол, но экспрессии гена АОХ1 не происходит (Lin-Cereghino et al., 2006).Недавно был выявлен другой белок, вовлечённый в регуляцию экспрессиигенов метаболизма метанола, который относится к семейству 14-3-3 (Parua et al.,2012).
Данный белок консервативен у всех эукариот и может взаимодействовать смножеством функционально различных белков, включая фосфатазы, киназы итрансмембранные белки. Белки семейства 14-3-3 вовлечены в регуляциюразличных клеточных процессов. Так, гомологи белка 14-3-3 у дрожжей S.cerevisiae – белки Bmh1 и Bmh2 – участвуют в регуляции активности белка Adr1,гомолога Mxr1р. Регуляция происходит путем фосфорилирования остатковсерина или треонина. Позднее было показано, что тем же образом белок 14-3-3регулирует активность Mxr1p в дрожжах P. рastoris (Vogl & Glieder, 2013).Помимо этого, белки Bmh1 и Bmh2 у S. cerevisiae являются ключевымиучастниками пути ретроградной регуляции.
Эти белки в комплексе с негативнымрегулятором Mks1p связывают ТФ Rtg1p/Rtg3p и удерживают их в цитоплазмепри наличие в среде богатых источников азота (Loewith & Hall, 2011).Еще один активирующий белок – Prm1 был обнаружен группой Такаги(Tagaki et al., 2012) у мутанта с нарушениями роста на среде с метанолом, но cсохранением нормального роста на среде с глюкозой. Поэтому он был назван«позитивным регулятором метанола» (positive regulator of methanol). Делецияданного гена уменьшает экспрессию генов АОХ1 и DAS, но не блокирует ихактивность полностью (Vogl & Glieder, 2013).Было обнаружено, что в катаболитную репрессию генов алкогольоксидазвносят свой вклад транспортеры гексоз, глюкокиназы и гексокиназы.
Примутациях в соответствующих генах экспрессия АОХ1 и AOX2 может происходитьв присутствии глюкозы в среде. Влияние данных мутаций показано не только уP. pastoris, но и у H. polymorpha (Ozimek et al., 2005; Vogl & Glieder, 2013).Недавно было продемонстрировано участие в регуляции гена АОХ1 белка зетакристаллина (Zta1), который связывается с одноцепочечной ДНК (Kranthi et al.,382006). В регуляцию активности АОХ2, предположительно, вовлечен цитохром С(Vogl & Glieder, 2013).Относительно недавно был проведен анализ белка Rop (Repressor ofPhosphoenolpyruvate Carboxykinase), который подавляет метанол-индуцированнуюэкспрессию AOX1 у P. pastoris, при культивировании клеток в богатой среде,содержащей экстракт дрожжей, пептон и метанол (Kumar, Rangarajan, 2012).
Ropпредставляет собой белок, содержащий домен «цинковые пальцы», экспрессиякоторого усиливается у P. pastoris в среде, содержащей глюкозу и аммоний. Приэтом обязательным условием является отсутствие биотина.Делеция гена, кодирующего Rop, приводит к усилению AOXI, асверхэкспрессия ROP приводит к репрессии гена AOXI и замедлению роста P.pastorisвсредахсметанолом.Исследованияinvitroпоказали,чтопоследовательность промотора AOXI, содержащая 5′ CYCCNY 3′ мотив, служитсайтом связывания как для Mxr1р, так и для Rop, которые регулируют метаболизмметанола как антагонисты (Kumar, Rangarajan, 2012).Общая схема, отражающая современные представления о механизмахрегуляции генов метаболизма метанола у дрожжей P. pastoris представлена нарисунке 7.39Рисунок 7. Транскрипционные факторы, вовлечённые в регуляцию геновметаболизма метанола у дрожжей P.
pastoris (по Vogl & Glieder, 2013). Зеленымцветом обозначены позитивные регуляторы. Белок Mxr1 является ключевымрегулятором, осуществляющим индукцию MUT- и PEX- генов при наличиеметанола в среде в качестве единственного источника углерода. Активность белкаMxr1 негативно регулируется белком семейства 14-3-3, гомологом которогоявляетсябелокBmh1дрожжейS.cerevisiae.БелкиPrm1риZta1рпредположительно так же вовлечены в регуляцию гена гена АОХ1 в качествеположительных регуляторов.Оранжевымцветомобозначены белки,вовлеченныев негативнуюрегуляцию.
Транспортеры гексоз, в частности Hxt1p, участвуют в катаболитнойрепрессии генов алкогольоксидаз, при наличие глюкозы в среде (Zhang et al.,2010). Белок Rop1, являющийся репрессором фосфоенолпируваткарбоксилазыспособен связываться с промоторами MUT- и PEX- генов, ингибируя ихактивность в богатых средах, содержащих дрожжевой экстракт и пептон.40У вида H. polymorpha были найдены гомологи белков S. cerevisiae,обеспечивающих репрессию генов при наличии глюкозы в среде: Snf1p (серин –треониновая киназа) и Tup1p (репрессор транскрипции).
Если отсутствие Tup1pне влияет на рост и экспрессию генов пути утилизации метанола, то отсутствиеSnf1p привело к снижению уровня транскрипции генов MOX и DAS при индукцииметанолом. При этом скорость роста штамма с делецией Snf1p не отличается отскорости роста штамма дикого типа (Hartner et al., 2006; Hristozova et al., 2002).2.3. Взаимодействие сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию азотного иуглеродного метаболизмаПомимо обеспечения азотной катаболитной репрессии, Tor-киназы играютключевую роль в координации углеродного и азотного метаболизма. TORC1комплекс является ключевым звеном координированной регуляции экспрессииядерных и митохондриальных генов – ретроградной регуляции (Cardenas et al.,1999).Дляиспользованиябедныхисточниковазотаклеткамдрожжейнеобходимы ферменты, катализирующе первые реакции цикла трикарбоновыхкислот. При этом у S.
cerevisiae гены, кодирующие данные ферменты,репрессируются при наличии глюкозы в среде. Таким образом, для обеспеченияоптимального роста на средах с глюкозой и бедными источниками азота клеткамдрожжей необходима система, которая будет противодействовать глюкознойрепрессии. Такую функцию выполняет сигнальный путь ретрограднойрегуляции, который стимулирует экспрессию генов, вовлечённых в циклтрикарбоновых кислот даже в присутствии глюкозы (Рис. 8).Центральную роль в ретроградной регуляции играют транскрипционныеактиваторы Rtg1p и Rtg3p, функционирующие в составе гетеродимеров. Приналичии в среде богатых источников азота Tor-киназа фосфорилирует негативныйрегулятор Mks1p, который затем взаимодействует с белками семейства 14-3-3Bmh1 и Bmh2. Образующийся комплекс связывает гетеродимеры Rtg1/Rtg3 и41удерживает их в цитоплазме.
Помимо этого Tor-киназа может фосфорилироватьсами белки-активаторы Rtg1 и Rtg3, что так же препятствует их транспорту вядро. При истощении богатых источников азота Mks1р дефосфорилируется, а егокомплексы с белками Bmh1 и Bmh2 диссоциируют. Гетеродимеры Rtg1p/Rtg3pнаправляются в ядро и стимулируют экспрессию генов, подверженныхретроградной регуляции (Loewith & Hall, 2011).Рисунок 8.
Механизмы ретроградной регуляции у S. cerevisiae при наличиив среде глюкозы как источника углерода (по Loewith & Hall, 2011). Если доступныбогатые источники азота Tor-киназный комплекс фосфорилирует Mks1p, которыйзатем связывается с белками Bmh1 и Bmh2. Образующийся комплекспрепятствует транспорту ТФ Rtg1p и Rtg3p в ядро.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
