Диссертация (1145914), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Гены HXT2 и HXT4, наоборот, индуцируются при низкойконцентрации. Активность же генов HXT3 и HXT5 не зависит от наличия глюкозыв среде (Busti et al., 2010).После попадания в клетку глюкоза фосфорилируется гексокиназами собразованием глюкозо-6-фосфата. В ряде экспериментов было показано наличиекорреляции между процессами глюкозной репрессии и способностью клетокфосфорилировать глюкозу (Rose et al., 1991).
Ключевую роль в этих процессахиграет гексокиназа Hxk2 (Entian, 1980), мишенью для которой служит белок Snf1.21Рисунок 4. Основной механизм обеспечения глюкозной катаболитнойрепрессии у S. cerevisiae. Поступление глюкозы в клетку с помощью траспортеровгексоз Hxt и её фосфорилирование гексокиназами Hxk приводит к инактивациипротеинкиназы Snf1р.
В результате Mig1p попадает в ядро и в комплексе с Tup1 иSsn6 осуществляет репрессию транскрипции. Репрессии подвержены в частностигены, кодирующие ферменты участвующие в метаболизме мальтозы (MAL гены),галактозы (GAL гены), а так же в глюконеогенезе и дыхании (по Verstrepen et al.,2004).Центральнымкомпонентомсигнальногопути,обеспечивающегоглюкозную катаболитную репрессию у дрожжей, является комплекс SNF1,состоящий из белка Snf1, γ-подобной регуляторной субъединицы Snf4, и одной изтрех β-субъединиц, кодируемых генами GAL83, SIP1 и SIP2 (Zaman et al., 2008).При наличии глюкозы в среде регуляторный домен белка Snf1 связан скаталитическим доменом, что ингибирует его киназную активность (Jiang &Carlson, 1996).
При дефиците глюкозы другой компонент комплекса, белок Snf4,блокирует регуляторный домен Snf1. Основную роль в регуляции подобных22конформационных преобразований Snf1р играют гексокиназы Hxk2 and Grr1(Gancedo, 1998). Последующее фосфорилирование белка Snf1, осуществляетсякиназами, кодируемыми генами SAK1 (Snf1 Activating Kinase), ELM1 и TOS3(Hong et al., 2003).КиназныйкомплексSNF1засчётфосфорилированиярегулируетфункциональную активность белка Mig1. Этот транскрипционный факторсодержит ДНК-связывающий домен «цинковые пальцы», позволяющий емувзаимодействовать с промоторами генов, репрессируемых глюкозой.
На N-концеMig1р расположен домен, обеспечивающий его направленный транспорт в ядро(Klein et al., 1998).У дрожжей S. cerevisiae идентифицированы еще два белка, сходные с Mig1р– Mig2р и Mig3р (Westholm et al., 2008; Lutfiya et al., 1998). Функциональнаязначимость Mig2р ниже, чем Mig1р и предполагается, что он действует толькосовместно с Mig1р (Westholm et al., 2008). Другой белок Mig3 только косвенноучаствует в репрессии отдельных генов, включая SUC2, HXT2, SNF3 и MTH1(Kaniak et al., 2004).Помимо фосфорилирования Mig1р комплекс SNF1 участвует в регуляцииряда других транскрипционных факторов - Adr1р (Schuller, 2003), Cat8р и Sip4р(Zaman et al., 2008). Для полного преодоления глюкозной репрессии необходимаактивация Adr1р и Snf1р (Tachibana et al.
2007).Активатор транскрипции Adr1р регулирует экспрессию гена ADH2,кодирующего алкогольдегидрогеназу 2 (Ciriacy, 1975; Eisen et al., 1988), а так жегенов, кодирующих белки пероксисом и ферменты утилизации глицерина (Simonet al., 1991; Pavlik et al., 1993).
Увеличение концентрации глюкозы в средеингибирует активность Adr1р, что приводит к репрессии ADH2. АктивностьAdr1р регулируется за счёт фосфорилирования (Cherry et al., 1989). Такжепродемонстрировано, что деацетилирование гистонов промотора гена ADH2препятствует его связыванию с активатором транскрипции Adr1р (Blumberg et al.,1988).23Рассмотренные механизмы глюкозной катаболитной репрессии вовлечены врегуляцию транскрипционной активности генов. При этом регуляция экспрессииряда генов так же осуществляется и на посттранскрипционном уровне за счётизменения стабильности мРНК или белков.
Так повышение концентрацииглюкозы в среде влияет на стабильность мРНК гена ADH2. При росте клеток насреде с глюкозой период полураспада мРНК ADR1 снижается от 2 ч до 45 мин(Cook, Denis, 1993). Так же в случае глюкозной репрессии происходит деградациярядабелковсучастиемвакуолейипротеосом,вчастностифосфоенолпируваткарбоксилазы и некоторых транспортных мембранных белков,например, симпортеров мальтозы Mal61р и глицерина Stl1р (Riballo et al., 1995;Paiva et al., 2002; Ferreira et al., 2005, Hung et al., 2004). В регуляции этихпроцессов участвуют также белки Reg1, Grr1, Rgt1 (Gancedo, 2008).Необходимо отметить, что наиболее детальная и систематизированнаяинформация о механизмах и компонентах глюкозной репрессии получена толькодля S.
cerevisae. Другие виды дрожжей в этом отношении изучены хуже.МетаболизмметанолаудрожжейP.pastoris.Одноуглеродныесоединения, такие как метан и метанол, широко распространены в природе. Впроцессе эволюции ряд микроорганизмов приобрел способность использовать этисоединения в качестве источников углерода и энергии. Это явление получилоназвание метилотрофии. У метилотрофных бактерий, первые реакции окисленияметанола катализируются дегидрогеназами, связанными с электрон-транспортнойцепью (Christoserdova, 2011). У эукариотических организмов путь утилизацииметанола в корне отличается от такового у прокариот и включает в себя рядуникальных ферментов (Anthony, 1982).Способность ряда дрожжей использовать метанол в качестве источникауглерода и энергии была впервые описана Койчи Огатой (Koichi Ogata) (Ogata etal., 1969).
Наряду с дрожжами P. pastoris одним из первых обнаруженных видовметилотрофных дрожжей стали дрожжи Kloeckera sp. No.2201, позднеепереименованные в Candida boidinii (Ogata et al., 1969). Вскоре были открыты24другие виды дрожжей, способные утилизировать метиловый спирт, в том числеHansenula polymorpha, ныне известных как Pichia angusta (Hazeu et al., 1972). Насегодняшнийденьизвестнооколо30видовметилотрофныхдрожжей,большинство из которых относятся к трем кладам Ogataea, Kuraishia иKomagataella (Kurtzman & Robnett, 1998). В отличие от бактерий, эти дрожжиспособны использовать только метанол, но не метан, в качестве источникауглерода.
При этом они так же способны использовать метиламин, но только какисточник азота (Chung et al., 2010).В природе метилотрофные дрожжи чаще всего встречаются на поверхностиплодов, в гниющей древесине и на коре деревьев. Основным источникомметанола в этих условиях является разложение веществ, богатых метоксигруппами – лигнина и пектина.
Показано, что все известные виды метилотрофныхдрожжей способны расти на среде с пектином, который содержится в большихколичествах во фруктах и овощах (Blanco et al., 1999).Одним из самых известных представителей метилотрофных дрожжейявляются P. pastoris, которые используются в современной биотехнологии дляпроизводства самых разнообразных белков в больших объемах. Столь широкоеиспользование дрожжей P. pastoris как системы синтеза рекомбинантных белковобусловлено рядом факторов. P. pastoris способны расти на средах относительнопростого состава и при этом достигать исключительно высоких значенийплотности культуры.
Это связано с тем, что P. pastoris являются облигатнымиаэробами и относятся к так называемым “Крэбтри негативным” (Crabtree negative)видам дрожжей. Они характеризуется дыхательным типом роста, что выгодноотличает P. pastoris от родственных им дрожжей S. cerevisiae, посколькупоследние утилизируют глюкозу в основном за счёт гликолиза и вырабатываютэтанол, что негативно влияет на рост культуры (Crabtree, 1928).В связи с тем, что эффективность синтеза рекомбинантного белка какправило пропорциональна плотности культуры, выращивание P.
pastoris довысоких плотностей дает исследователям большое преимущество. При этомвозможность P. pastoris расти на среде с метанолом, который негативно влияет на25жизнедеятельность большинства микроорганизмов, позволяет заметно снизитьриск контаминации (Cregg et al., 2000).Среди других преимуществ дрожжей P. pastoris как объекта биотехнологииследует назвать наличие необычайно сильных и при этом строго регулируемыхпромоторов.
Обычно для экспрессии гетерологичных генов в P. pastorisприменяются промоторы генов метаболизма метанола, в частности генаалкогольоксидазы AOX1.Все эти факторы сделали P. рastoris одной из самых эффективных изизвестных систем экспрессии гетерологичных генов. Опыт применения этихдрожжей в биотехнологии показал, что вероятность успешного синтеза любогочужеродного белка с помощью P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
