Диссертация (1145914), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

Наличие делеции в гене PpURE2 у полученных клоновпроверяли методами ПЦР и секвенирования (см. Приложения). Один изтрансформантов tr7-4-GS115 (Ppure2∆ZeoR phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4)использовали в дальнейшей работе.84Чтобы оценить влияние делеции в гене PpURE2 на регуляцию промотора генаAOX1 выращивали штаммы tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr7-4GS115 (Ppure2∆Shble phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4) в средах с метанолом исульфатом аммония или пролином. После 40 часов культивирования измерялиактивность КФ (рис. 23).**Рисунок 23.

Удельная активность КФ Pho5p (OD410/OD550), секретируемойштаммами P. pastoris tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr7-4-GS115(Ppure2∆ZeoR phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4), в зависимости от типа источникаазота в среде. Символом * обозначено достоверное различие удельной активностиКФ (p-value < 0,01).В том случае, если бы Ure2p участвовал в выявленной регуляции, делеция вгене PpURE2 должна была привести к отсутствию репрессии промотора AOX1пролином. Как видно из рисунка 24, наличие данной делеции не влияет нарегуляцию промотора AOX1 пролином, следовательно Ure2p у P. pastoris неучаствует в регуляции гена АОХ1.854.7.

Пролин и глутамат как комплексные источники азота и углерода дляP. pastorisЭксперименты по культивированию штамма GS115 в средах различногосостава показали, что пролин и глутамат влияют на рост культур только в средах сметанолом, который является менее доступным для усвоения, чем глицерин.Причём использование этих двух источников азота у P. pastoris приводило кросту культуры до больших клеточных плотностей по сравнению с сульфатомаммония, глутамином и мочевиной. Тогда как для дрожжей S. cerevisiae показано,что использование бедных источников азота – пролина, мочевины и глутамата,наоборот, приводит к замедленному росту культуры (Magasanik& Kaiser, 2002).Эти результаты позволили предположить, что в дрожжи P. pastoris способныиспользовать пролин и глутамат в качестве комплексных источников азота иуглерода.

Для проверки этого предположения культивировали штамм GS115 всредах, содержавших только сульфат аммония, глутамин, глутамат, мочевину илипролин (Рис. 24).Рисунок 24. Кривые роста штамма GS115 P. pastoris в средах содержащихсульфат аммония, глутамин, глутамат, мочевину или пролин в качествеединственных источников азота и углерода.86Как видно из рисунка 24 дрожжи P. pastoris способны расти на средах спролином и глутаматом в качестве комплексных источников азота и углерода.При этом они не растут в средах содержавших только сульфат аммония, глутаминили мочевину.Эксперименты со штаммом tr7-GS115 (Ppure2∆Shble his4::PAOX1-PHO5 HIS4)несущим делецию в гене PpURE2, позволяют предположить, чтомеханизмыазотной катаболитной репрессии не участвуют в обнаруженной регуляциипромотора АОХ1 пролином.

Чтобы это подтвердить исследовали активностьпромотора АОХ1 в средах с метанолом, содержавших смесь пролина и сульфатааммония. Штамм tr2-1-GS115 культивировали в средах с метанолом в течение 40часов. Результаты измерения удельной активности КФ представлены на рисунке25.Рисунок 25. Удельная активность КФ Pho5 (OD410/OD550), секретируемойштаммом tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) P.

pastoris. Использовалисреду с метанолом и сульфатом аммония, а так же среду с метанолом и смесьюпролина и сульфата аммония. Наблюдали достоверное различие удельнойактивности КФ (p-value < 0,05).87Показано, что у P. pastoris несмотря на присутствие сульфата аммония всреде, промотор АОХ1 репрессируется при добавлении пролина. Таким образом,регуляция гена АОХ1, а так же остальных MUT- и PEX-генов пролином иглутаматом отлична от азотной катаболитной репрессии и, возможно, связана стем, что они используются дрожжами P.

pastoris в качестве комплексныхисточников азота и углерода.У дрожжей S. cerevisiae добавление богатого источника азота - сульфатааммония в среду приводит к активации азотной катаболитной репрессии ипрепятствует синтезу ферментов, обеспечивающих транспорт и утилизациюбедных источников азота, в частности пролина (Magasanik& Kaiser, 2002).Очевидно, что у дрожжей P. pastoris на средах с метанолом в качестве источникауглерода, пролин транспортируется внутрь клетки и метаболизируется, даженесмотря на наличие в среде богатого источника азота – сульфата аммония. Такимобразом, полученные результаты свидетельствуют так же и о наличиикардинальных различий в механизмах азотной регуляции у дрожжей P.

pastoris иS. cerevisiae.4.8. Делеционный анализ промотора гена AOX1Для выявления регуляторных элементов промотора гена AOX1, участвующих вего регуляции был проведен делеционный анализ. Для этого на основе плазмидыpPIC9-AOX1-PHO5 были созданы генетические конструкции, содержащиеделеции различной протяжённости внутри промоторной области гена AOX1.В составе промотора AOX1 имеются уникальные сайты рестрикции SacI, PmeI,EspI и NsiI которые были использованы для внесения делеций (Рис. 26).88Рисунок 26. Сайты рестрикции SacI, PmeI, Esp и NsiI, в промоторе гена AOX1.При конструировании плазмид проводили рестрикцию вектора pPIC9-AOX1PHO5 по одному из данных сайтов внутри промотора AOX1 и по сайту AatII.Достраивали «липкие концы», образующиеся в результате рестрикции, спомощью Pfu-полимеразы и проводили лигирование полученного вектора. Общаясхема конструирования представлена на рисунке 27.

Наличие делеций впоследовательности промотора гена AOX1 подтверждали методами ПЦР исеквенирования (см. Приложения).89Рисунок 27. Схема конструирования плазмид, содержащих делеции различнойпротяжённости внутри промоторной области гена AOX1.Штамм 4-GS115 (his4 phox) трансформировали линеаризованными по сайтуStuI фрагментами полученных плазмид, что обеспечивало их встраивание в локусhis4. У трансформантов с помощью ПЦР было подтверждено наличие требуемыхделеций. Для дальнейшей работы было выбрано по одному клону: trSacI-1GS115, trPmeI-1-GS115, trEspI-1-GS115 и trNsiI-1-GS115. Штамм tr2-1-GS115,несущий конструкцию с нативным промотором, был использован в качествеконтроля.

Активность КФу трансформантов анализировали на средах,содержащих глюкозу или метанол в качестве источника углерода. У всехполученных трансформантов активность КФ проявлялась только после индукциипромотора АОХ1 метанолом. Значимые различия в активности КФ на средах сметанолом по сравнению с контролем наблюдали только у трансформантов90trEspI-4-GS115 и trNsiI-4-GS115, несущих делеции промотора AOX1 размером в613 п.о. и 671 п.о. соответственно (Табл.

7).Таблица 7.Активность КФ на средах с метанолом у штаммов P. pastoris несущихконструкции с делециями различной протяжённости внутри промоторе AOX1ШтаммАктивность КФ на среде ММс метаноломtr2-1-GS115trΔSacI-4-GS115trΔPmeI-4-GS115trΔEspI-4-GS115trΔNsiI-4-GS115После выращивания штаммов trEspI-4-GS115 и trNsiI-4-GS115 в средах MMс метанолом и различными источниками азота в течение 40 часов, измерялиудельную активность КФ в культуре дрожжей и сравнивали её с активностьюштамма tr2-1-GS115, несущего нативный промотор.91Рисунок 28. Удельная активность КФ Pho5p (OD410/OD550), секретируемойштаммами P. pastoris tr2-1-GS115 и trNsiI-4-GS115, в зависимости от разныхтипов источника азота в среде.У трансформантов trEspI-4-GS115 и trNsiI-4-GS115 удельная активность КФбыла заметно снижена по сравнению со штаммом tr2-1-GS115, несущим нативныйпромотор AOX1 и составляла только 25% и 16% соответственно.

Но при этомдаже у трансформанта trNsiI-4-GS115, содержащего промотор AOX1 с делециейв 671 п.о., сохранялась его регуляция источником азота в среде (Рис. 28).Оставшийся участок промотора размером 267 п.о. оказался достаточен дляобеспечения его регуляции в зависимости от типа источника азота в среде. Этотучасток был разбит на 4 фрагмента – А, В, С и D, которые частичноперекрываются.

Фрагмент А (от −296 до −216 н.) имеет протяжённость 80нуклеотидов, фрагмент В (от −222 до −188 н.) – 34 н., фрагмент С (от −205 до −45н.) – 160 н., а фрагмент D (от −80 до −0 н.) – 80 н. (Рис. 29).92Рисунок 29. Схема расположения делеций в промоторe гена AOX1 в составеплазмид pPIC9-AOX1delA-PHO5, pPIC9-AOX1delB-PHO5, pPIC9-AOX1delC-PHO5и pPIC9-AOX1delD-PHO5. Показан основной сайт связывания белка Mxr1p(Kranthi et al., 2009).Делеции указанных фрагментов были внесены в последовательность промотораАОХ1 в составе плазмиды pPIC9-AOX1-PHO5. При этом использовали методысайт-направленного мутагенеза.

Характеристики

Список файлов диссертации