Диссертация (1145914), страница 16
Текст из файла (страница 16)
pastorisПолученный в ходе исследований штамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1PHO5 HIS4) имеет фенотип Mut+, тогда как при синтезе рекомбинантных белковчащеиспользуютсяMutSштаммы.Поэтомудляоптимизацииусловийкультивирования штаммов P. pastoris – продуцентов рекомбинантных белков былсозданштаммtr1-4-GS115(phoxaox1::PAOX1-PHO5HIS4).Дляэтоготрансформировали штамм 4-GS115 плазмидой pPIC9-PHO5, линеариаризованнойс помощью рестриктазы BglII.
Такой способ трансформации обеспечиваетзамещениелокусатрансформантыАОХ1будутнаиметьрепортернуюфенотипMuts.конструкциюОтобранныеиполученныеклоныбылипроанализированы с помощью ПЦР и секвенирования. У всех отобранныхтрансформантов активность КФ проявлялась только при индукции метанолом.Один из них - tr1-4-GS115 (phox aox1::PAOX1-PHO5 HIS4) был использован длядальнейшей работы.Культивирование штамма tr1-4-GS115 проводили в две стадии: (1) сначаланаращивали биомассу, после чего проводили (2) индукцию метанолом. Подобнаясхема часто используется в биотехнологии при синтезе рекомбинантных белков.На первом этапе выращивали культуры штамма tr1-4-GS115 в колбахобъёмом 100 мл до стационарной фазы в среде MG, содержащей глицерин вкачестве источника углерода.
Далее переносили клетки в среды для индукции,содержащие 1% метанола и проводили измерение удельной активности КФ вкультуре. Максимальные значения удельной активности КФ в культуредостигались после 40 часов индукции.Данный эксперимент был масштабирован, для чего использовался ферментеробъёмом 5 л. Проводили наращивание биомассы штамма tr1-4-GS115 в среде с112глицерином в качестве источника углерода.
Через 50 часов роста, когда культурадостигаластационарнойфазы,проводилииндукциюпромотораАОХ1добавлением метанола в среду до концентрации в 1%. Максимальные значенияудельной активности КФ у тестерного штамма tr1-4-GS115 P. pastoris прикультивировании в ферментёре достигались всего за 30 часов и были значительновыше, чем при культивировании в колбах малого объёма. Скорее всего, этоявляется следствием более интенсивной аэрации и перемешивания в условияхферментера.В ходе дальнейших экспериментов с помощью штамма tr1-4-GS115подбиралиоптимальнуюсхемуиндукциипромотораАОХ1метанолом,позволяющую получить максимальные значения удельной активности КФ вкультуре (рис. 43).
Было показано, что повторное добавление метанола дляусиления активности промотора АОХ1 выгоднее проводить примерно через 22часа после первой индукции, когда удельная активность КФ ещё не достигаетсвоих максимальных значений, но уже идёт замедление её роста, что являетсяследствием исчерпания метанола в культуре. При этом на более поздних стадияхкультивирования время между индукциями следует сократить ещё больше – до 15часов.Рисунок 43. Оптимальная схема индукции синтеза репортерной КФ штаммомtr1-4-GS115 (phox aox1::PAOX1-PHO5 HIS4) добавлением метанола в среду.
В113среду добавляется 1% метанола в начале через 22 часа (индукции №1,2,3,4), далеечерез каждые 15 часов (индукции №5,6,7,8).Используя подобранную схему индукции промотора АОХ1 метанолом,исследовали влияние источника азота на уровень синтеза рекомбинантного белкав больших объёмах. В качестве источников азота использовали сульфат аммонияи мочевину, поскольку было показано, что они не ингибируют активностьпромотора АОХ1. Выбор мочевины так же был связан с её относительнойдешевизной, а так же с тем фактом, что в ряде работ она используется дляповышения выхода рекомбинантных белков за счёт их стабилизации.
На рисунке44 приведены результаты оценки удельной активности КФ при культивированииштамма tr1-4-GS115 в течение 72 часов в ферментере объёмом 5 л в средах ссульфатом аммония и мочевиной.Рисунок44.СравнениеудельныхактивностейКФ(OD410/OD550),синтезируемой штаммом tr1-4-GS115 при культивировании 72 часа в большомобъёме в зависимости от типа источника азота в среде.114Показано, что уровни синтеза КФ при культивировании в больших объёмахиспользовании мочевины в качестве источника азота сопоставимы с уровнямидемонстрируемыми штаммом tr1-4-GS115 при росте в средах с сульфатомаммония. Так же было обнаружено, что при культивировании дрожжей P. pastorisв среде с мочевиной происходит изменение рН культуры с 6.0 до 9.0.Далее была проведена оценка влияния различных типов источников азота напродукцию целевого рекомбинантного белка.
Для этого был использован штаммγ-GS115(aox1::PAOX1-chIFNγбиохимическойгенетики.HIS4),Данныйсозданныйштаммранеесодержитввлабораториисвоёмгеномепоследовательность кДНК структурного гена куриного интерферона-гамма(ИФН-γ) под контролем промотора АОХ1. В течение 40 часов нарабатывалибиомассу клеток штамма γ-GS115 в средах с MG глицерином, после чегоиндуцировали синтез белка, перенося культуры в среды MM с метанолом. Вкачестве источников азота использовали сульфат аммония, пролин, мочевину ипептон. Индукцию проводили в течение 60 часов, добавляя 1% метанола черезкаждые 22 часа. Затем центрифугировали клетки и отбирали 15 мл среды,содержавшей секретированный штаммом-продуцентом ИФН-γ.
Среду переносилив диализные мешки, которые затем помещали в сефадекс. Концентрированиебелка проводили в течение 24 часов за счёт адсорбции воды из диализного мешка.Для того чтобы убрать остатки токсичного метанола пробы помещали в буфер ТЕрН 8.0. После 10 часов диализа пробы разводили до одинаковых объёмов – 2 мл.Наследующемэтапепроводиликультивированиеклеток первичныхфибробластов курицы. К пробам добавляли равные объёмы (100 мкл) растворовИФН-γ, синтезированного в средах с разними источниками азота. После 24 часовкультивированияпроводиливыделениетотальнойРНК,которуюзатемиспользовали для постановки реакции обратной транскрипции и проведения ПЦРв режиме реального времени.В качестве мишеней были выбраны гены, экспрессия которых индуцируетсяв ответ на интерфероны.
Один из них - PKR, кодирует дцРНК-зависимаяпротеинкиназу, которая фосфорилирует фактор инициации трансляции эукариот115eIF2 и участвует в обеспечении противовирусного действия интерферона, служитпосредником при активации транскрипции генов, экспрессия которых зависит отинтерферона (Okumura et al., 2013). Еще одним геном, активность которогоиндуцируется интерфероном, является ген OASL 2'-5'-олигоаденилатсинтетазы.Так же использовали ген MX1, который кодирует интерферон-индуцируемуюГТФ-азу. Оценка уровня экспрессии гена MX1 человека используется вклинических исследованиях в качестве маркера дифференциации вирусных ибактериальных инфекций, а также надежного маркера для оценки биодоступностиинтерфероновIтипа(Verhelstetal.,2013).Генглицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве референсного.Результаты, представленные на рисунке 45, показывают, что в присутствииИФН-γ курицы уровень экспрессии генов PKR, OASL и MX1 относительноконтрольного гена GAPDH возрастает по сравнению с контрольным образцом,содержащим белки культуральной среды исходного штамма.Рисунок 45.
Относительные уровни мРНК генов PKR, OASL и MX1 в клеткахКЭФвприсутствиирекомбинантногоинтерферонакурицыИФН-γ,синтезированного с помощью штамма γ-GS115 в средах с сульфатом аммония,116пептоном или пролином. В качестве контроля использовали среду, в которойкультивировали исходный штамм GS115, не синтезирующий интерферон.Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ (p-value< 0.05).Уровни экспрессии исследуемых генов были максимальными в пробах, вкоторые был добавлен рекомбинантный интерферон курицы, синтезированныйпри культивировании штамма γ-GS115 в средах с сульфатом аммония.Добавление в среду для синтеза белка пролина или пептона приводило кснижению уровня синтеза белка, что в итоге приводило к низким уровнямэкспрессии генов индуцированных интерфероном в культурах фибробластовкурицы.Полученные результаты имеют важное практическое значение длябиотехнологии.
Добавление пептона в среду для культивирования шаммовпродуцентов является одним из способов снижения уровня протеолизарекомбинантного белка. Пролин так же в ряде случаев добавляют в среды длясинтезабелковвкачествеагента,позволяющегоснизитьстрессорноевоздействие, оказываемое на клетки штамма-продуцента синтезируемым белком.1175. ЗаключениеУбактерийсогласованнаяэкспрессиягеновметаболическихпутейдостигается на уровне транскрипции за счет организации генов в опероны. Уэукариот классических оперонов не обнаружено, но гены, кодирующие ферментыодного метаболического пути, как правило, имеют в промоторных областях общиерегуляторные последовательности и таким образом формируют регулоны (Johnson& Carlson, 1992).
Кроме того, в настоящее время становится очевидным, чтосуществуют надрегулонные механизмы, координирующие экспрессию разныхметаболических путей в ответ на изменение условий среды.В ходе исследования мы показали, что экспрессия генов, кодирующихосновные ферменты пути утилизации метанола у P. pastoris (AOX1, AOX2, СAT1,DAK, DAS, FLD, FGH), а так же генов, кодирующие белки, вовлеченные в биогенези функционирование пероксисом (PpPEX5, PpPEX8, PpPEX14 и PpPЕХ1), строгорегулируется в зависимости от типа источника азота в среде.
Для всехисследованных генов наблюдается репрессия в средах с пролином, а для гена AOX1показано так же снижение активности в средах с глутаматом и аспарагином.Обнаруженная регуляция предположительно осуществляется на транскрипционномуровне за счёт изменения активности промоторов MUT- и PEX- генов.Поскольку наличие пролина в среде изменяет экспрессию ключевых PEXгенов, следует ожидать, что его действие проявится на уровне самих пероксисом.Метилотрофные дрожжи зарекомендовали себя как удобный модельный объект дляизучения этих клеточных органелл (Cregg et al., 1993).
Однако в основномисследования затрагивали механизмы индукции их биогенеза метанолом ипексофагииприпоявлениибогатыхисточниковуглерода.Дальнейшиеисследования с использованием пролина и других аминокислот позволят выявитьновые аспекты тонкой регуляции функционирования этих органелл при измененииусловий среды.У дрожжей основные этапы утилизации пролина локализованы в матриксемитохондрий. В ряде исследований были показано наличие взаимодействия118пероксисом и митохондрий внутри клетки. В частности у S. сerevisiae в процессахделения этих органелл участвуют одни и те же белки (Dnm1p и Fis1p). Так же былапоказана возможность их прямого физического контакта (Klecker et al., 2014).Однако подобные исследования у P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
