Диссертация (1145832), страница 17
Текст из файла (страница 17)
14).73Рисунок 14. Корреляция между долей сперматозоидов с 5hmC и параметрами эякулятачеловека.Статистическизначимыекорреляцииобведеныврамку(P<0,05,непараметрический тест Спирмена). Показаны линии регрессии, коэффициент корреляцииСпирмена r и P-значения.Такимобразом,содержаниесперматозоидоввзаимосвязаносперматозоидовссвэякулятепараметрамифрагментированнойДНК.высокогидроксиметилированныхспермограммыПриэтом,исодержаниемнаблюдаетсясильнаяотрицательная корреляция с показателями хорошего качества спермы – частотойморфологически нормальных сперматозоидов и сперматозоидов с нормальной головкой, исильная положительная корреляция с показателем плохо качества спермы – частотойTUNEL-положительных сперматозоидов.3.2.4. Становление рисунка гидроксиметилирования и метилирования ДНК всперматогенных клетках человекаСледующий вопрос, возникший в настоящем исследовании, касается того, когда всперматогенезе устанавливается высокий уровень 5hmC, наблюдаемый в единичныхсперматозоидах в эякуляте.
Была проведена оценка содержания 5hmC и 5mC в геноме74сперматогенных клеток человека. Исследование было проведено на материале биоптатовсеменников 15 пациентов, имеющих нормальный кариотип, и диагноз азооспермия. Усеми пациентов был поставлен диагноз обструктивная азооспермия, у восьми –необструктивная азооспермия. Азооспермия – одна из причин мужского бесплодия.Азооспермия характеризуется полным отсутствием сперматозоидов в эякуляте, чтоявляется показанием для проведения диагностической биопсии яичка.
При обструктивнойазооспермии все стадии сперматогенеза в семенниках протекают нормально, однаковыходсперматозоидоввэякулятоказываетсяневозможениз-заобструкциисемявыводящих путей. Необструктивная азооспермия характеризуется нарушениемсперматогенеза на любой из его стадий. Нормально прохождение сперматогенеза упациентов с обструктивной азооспермией позволяет использовать полученный от нихбиопсированный материал в качестве группы сравнения.Содержание 5hmC и 5mC в интерфазных ядрах, хромосомах и сперматозоидах избиоптатов семенников, оценивали визуально после иммунофлуоресцентной детекцииданных соединений на цитогенетических препаратах.Напервомэтапепроанализированхарактергидроксиметилированияиметилирования митотических и мейотических хромосом сперматогенных клеток. Былиидентифицированы следующие типы клеток сперматогенного ряда на стадиях деления:сперматогонии, находящиеся на стадии метафазы митоза, и сперматоциты, находящиесяна стадиях профазы (пахитены, диплотены, диакинеза) и метафазы II мейоза.
5mC былвыявлен как в метафазных митотических хромосомах сперматогониев (n=51), так и вхромосомах на стадиях пахитены, диплотены, диакинеза и метафазы II мейозасперматоцитов (n=224) (рис. 15). Совсем иная картина была характерна для 5hmC: онотсутствовал на хромосомах митотически делящихся сперматогониев и мейотическиделящихся сперматоцитов. Таким образом, можно утверждать, что для хромосомделящихся сперматогенных клеток человека наличие 5hmC не характерно.75Рисунок 15. Интерфазные ядра и хромосомы из сперматогенных клеток после QFH/AcDокрашивания и иммунофлуоресцентного окрашивания с помощью антител к 5mC(флуорохром Cy3), 5hmC (флуорохром Alexa 488) и совмещённое изображение настадиях: А – сперматогоний на стадии метафазы митоза, Б – сперматоцит на стадиипахитены, В – сперматоцит на стадии диплотены, Г – сперматоцит на стадии диакинеза, Д– сперматоцит на стадии метафазы второго деления мейоза.На следующем этапе был проанализирован характер распределения 5hmC и 5mC винтерфазных ядрах сперматогенных клеток.
В отличие от 5mC, выявленного во всехинтерфазных ядрах, наличие 5hmC было характерно лишь для отдельных интерфазныхядер клеток биоптатов семенников. Для установления плоидности ядер, содержащих5hmC, использовали комбинацию двух методов: иммунофлуоресценой детекции 5hmC и5mC и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). FISH проводили до иммунодетекциимодифицированного цитозина. Для FISH использовали ДНК-зонды к прицентромернымрайонам хромосомы 1 (1p11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA = D1Z5, Abbott Molecular, США)и хромосомы 11 (11p11.11-q11 Alpha Satellite DNA = D11Z1, Abbott Molecular, США).Использование двух зондов исключает вероятность ошибочного определения плоидности76клеток. Последовательное использование методов FISH и иммунофлуоресцентнойдетекции 5hmC позволило выявить среди гидроксиметилированных ядер как диплоидные,так и гаплоидные.
Было охарактеризовано 4 типа интерфазных ядер, отличающихся поплоидности и характеру окрашивания с помощью специфических антител к 5hmC:диплоидныеокрашенные,диплоидныенеокрашенные,гаплоидныеокрашенные,гаплоидные неокрашенные (рис. 16).Рисунок 16. Совмещённое изображение гаплоидных и диплоидных ядер сперматогенныхклеток из биоптата семенника человека после окрашивания с помощью DAPI и антител к5hmC (зелёный, флуорохром Alexa 488) и последующей флуоресцентной гибридизации insitu с ДНК-зондами, специфичными к прицентромерным участкам хромосом 1(SpectrumOrange, жёлтый) и 11 (SpectrumAqua, голубой).На цитогенетических препаратах сперматогенных клеток каждого из 15 пациентовбыла установлена доля ядер каждого типа среди проанализированных 5000 ядер (табл. 4 вприложении).Процентное содержание ядер с 5hmC среди диплоидных клеток варьировало впределах от 32,62 до 52,57% (в среднем 40,75±5,89).
В тканях семенника человекадиплоидные клетки представлены, в основном, сперматогониями. В в тестикулярнойткани соотношение сперматогониев разных типов составляет Ad:Ap:В=1:1:2 (Аmаnn,772008). Сперматогонии типа Ad делятся митотически и поддерживают численностьпопуляции сперматогониев Ad и Ap типа. Сперматогонии типа Ap также делятся митозоми далее дифференцируются в сперматогонии типа В. Сперматогонии типа В делятсямитотически, затем вступают в мейоз. Среди диплоидных ядер, содержащих 5hmC,преобладали ядра с большой центральной вакуолью. Такая вакуоль, представляющаясобой зону разжижения хроматина в ядре, является характерным морфологическимпризнаком сперматогониев типа Ad, но не сперматогониев типа Ар или B (Clermont,1966).
Диплоидные ядра без вакуоли могут принадлежать либо соматическим клеткам,либосперматогониямАрилиB.Ядрабезвакуолисредидиплоидныхгидроксиметилированных ядер, выявленные в настоящем исследовании, составили неболее 1-2%.Содержание гаплоидных ядер с 5hmC составило 0,42-1,96% (в среднем 1,18±0,51)(рис. 17). Гаплоидные ядра в тестикулярной ткани – это ядра сперматид, прошедшихмейотическое деление.Соотношенияразныхнегидроксиметилированныхтиповядердиплоидных,(гидроксиметилированныхдиплоидных,гидроксиметилированныхгаплоидных,негидроксиметилированных гаплоидных) не различались между образами от разныхпациентов, в том числе не было выявлено различий между пациентами с обструктивной инеобструктивнойазооспермией(P=0,978,z-критерийФишера)(рис.17).Этосвидетельствует о том, что клетки на разных стадиях сперматогенеза были одинаковопредставлены у всех проанализированных индивидов, и что наблюдаемая картинараспределения 5hmC, вероятнее всего, определяется программой сперматогенеза, а неявляется результатом случайных воздействий, в результате которых наблюдалась бымежиндивидуальная вариабельность данного параметра.На препаратах из биоптатов семенников были идентифицированы сперматозоиды.В биоптатах всех пациентов было проанализировано суммарно 1455 сперматозоидов.
Всесперматозоиды были метилированы, но не содержали 5hmC.78Рисунок 17. Соотношение различных типов ядер в каждом из проанализированныхобразцов биоптатов семенника (n=15). Соотношения не отличаются между пациентами собструктивной и необструктивной азооспермией (P=0,978, z-критерий Фишера).Для подтверждения данных, полученных при иммунофлуоресцентной детекциигидроксиметилированной и метилированной ДНК на цитогенетических препаратах, былапроведена иммуногистохимическая детекция 5hmC и 5mC на срезах тестикулярной ткани.5mC присутствовал во всех типах клеток в семенных канальцах, а 5hmC был выявлентолько в некоторых клетках. Гидроксиметилированные клетки, в основном, былирасположены вблизи базальной мембраны и имели вакуоли (рис. 18).
Это подтверждаетзаключение о том, что они представляют собой сперматогонии типа Ad. Таким образом, вотличие от 5mC, который присутствует во всех тестикулярных клетках, 5hmCлокализуется почти исключительно в ядрах сперматогониев Ad типа, которыерасполагаются рядом с базальной мембраной, и в ядрах единичных сперматид.79Рисунок18.Иммуногистохимическаядетекция5-метилцитозина(5mC)и5-гидроксиметилцитозина (5hmC) на срезе семенных канальцев.Таким образом, в клетках тестикулярной ткани человека рапределение 5mCотличается от 5hmC. 5mC обнаружен во всех типах сперматогенных клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
