Диссертация (1145832), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Было проведено сравнениедоли сперматозоидов с высоким содержанием 5hmC между группой доноров спермы игруппой пациентов с нарушением фертильности. Процент сперматозоидов с высокимсодержанием 5hmC в группе доноров был низким и варьировал в небольшом диапазоне(0,02-0,46%), тогда как у пациентов с нарушениями фертильности процент таких92сперматозоидов колебался в широких пределах (0,12-21,24%), и был достоверно выше,чем у доноров (Р<0,0001; рис. 12 из «Результатов»).
Кроме того, среди пациентовпоказано значимое межиндивидуальное варьирование содержания сперматозоидов поуровню 5hmC.Таким образом, повышенный уровень содержания сперматозоидов с 5hmCхарактерен для пациентов из пар с бесплодием, и, по всей видимости, ассоциирован снарушениями фертильности. С помощью расчёта коэффициента корреляции по Спирменубыла показана сильная положительная корреляция доли высокогидроксиметилированныхсперматозоидов в эякуляте с показателем плохого качества спермы – частотой TUNELположительных сперматозоидов (r=0,46, P=0,001) и сильная отрицательная корреляция споказателями хорошего качества спермы – частотой морфологически нормальныхсперматозоидов (r=-0,567, P<0,0001) и сперматозоидов с нормальной формой головки (r=0,609, P<0,0001).
Таким образом, можно предположить, что высокая доля сперматозоидовс 5hmC в эякуляте является негативным прогностическим критерием фертильности. Чемхуже качество эякулята, тем больше вероятность, что в нём высока доля сперматозоидов,содержащих 5hmC. Таким образом, в результате проведённых исследований впервыепоказано, что высокая доля сперматозоидов с 5hmC в эякуляте является негативнымпрогностическим критерием фертильности, то есть выявлене 5hmC в сперматозоидахможет рассматриваться как один из новых возможных тестов для оценки качестваэякулята.Возможно, процесс окисления 5mC с образованием 5hmC вызывается активнымиформами кислорода (АФК), возникающими в результате оксидативного стресса. Известно,что редокс-активные хиноны индуцируют изменения метилирования ДНК, которыесопровождаются изменениями уровня 5hmC, 5fC, 5caC (Coulter et al., 2013; Zhao et al.,2014). Избыток АФК может быть вызван как внутренними, так и внешними факторами,такими как: курение, ожирение, недостаток антиоксидантов, воспалительный иинфекционные процессы, воздействие тяжелых металлов и радиации (Lopes et al., 1998).Образование АФК при окислительном стрессе связано с появлением в ДНК 5hmC.
Такжеизбыточное содержание АФК является основным механизмом, ответственным заповреждение ДНК сперматозоидов (Lopes et al., 1998). Обнаруженная в настоящемисследованиисильнаяположительнаякорреляциямеждудолейвысокогидроксиметилированных сперматозоидов и фрагментацией ДНК указывает на то,что АФК, вероятно, могут индуцировать оба процесса: превращение 5mC в 5hmC иповреждение ДНК. К окислению 5mC до 5hmC и далее до 5fC и 5caC может привестинепосредственное воздействие гидроксильных радикалов. Или же этот процесс может93быть опосредован окислительным стрессом, меняющим каталитическую активность TETферментов (Chia et al., 2011).
Таким образом, в сперматогенезе может иметь место ипрямое окисление 5mC гидроксильными радикалами. Появление в эякуляте отдельныхгидроксиметилированных сперматозоидов происходит, наиболее вероятно, в результатеспонтанного воздействия на них АФК в придатке яичка (эпидидимисе) именно в тотпериод спермиогенеза, когда геном гаметы наиболее уязвим в связи с отсутствиемпрактически всей цитоплазмы.Остаётся открытым вопрос, на каком этапе сперматогенеза установливаетсявысокийуровень5hmC,икакизменяетсяхарактерметилированияигидроксиметилирования во время этого многоэтапного процесса. В связи с этим былпроведён анализ распределения 5mC и 5hmC в гаметах, полученных из образцовбиоптатов яичка, в которых представлены все стадии сперматогенеза.В настоящей работе было показано, что в клетках тестикулярной ткани человека5mC и 5hmC распределены по-разному.
В отличие от 5mC, который обнаружен во всехтипах клеток сперматогенного ряда, 5hmC выявлен преимущественно в сперматогонияхтипа Ad и в отдельных сперматидах.Согласно данным литературы в сперматогенных клетках мышей содержание 5hmCварьирует: самый высокий уровень обнаружен в сперматогониях, а в сперматидах он нижеболее чем в 3 раза. Интересно отметить, что гены семейства TET экспрессируютсяактивнее в диплоидных сперматогенных клетках, а не в гаплоидных (Gan et al., 2013).Также показано, что в сперматоцитах мышей содержание 5hmC является самым низкимсреди всех клеток сперматогенного ряда (Gan et al., 2013). Это согласуется с другимисследованием, проведённым на гистологических срезах семенника человека, в которомпоказан высокий уровень 5hmC в сперматогониях Ad (Nettersheim et al., 2013).
Ранеепредполагали, что в ходе деления сперматогенных клеток происходит пассивная потеря5hmC, т.е. его уровень снижается с каждым делением клетки (Nettersheim et al., 2013; Ni etal., 2016). Однако, в настоящей работе во всех митотических и во всех мейотическиххромосомах не обнаружено ассиметрично гидроксиметилированных хромосом – маркеровзависимойотрепликациипотери5hmC. Такимобразом,удаление5hmCизсперматогониев происходит ещё до начала их дифференцировки в сперматоциты.Другим типом клеток из биоптата семенника, в которых присутствует 5hmC, былисперматиды.
Такие сперматиды составляли не более 2% от общего числа сперматид. Ранеепри анализе распределения 5hmC на гистологических срезах семенников было показано,что 5hmC присутствует только в удлиненных сперматидах (Ni et al., 2016). Таким образом,94процессактивногодеметилирования,сопровождающийэпигенетическоерепрограммирование половых клеток продолжается и в сперматидах.Анализ соотношения клеток сперматогенного ряда с 5-гидроксиметилцитозином ибез такового, показал, что характер распределения метки не отличается у всех пациентов снарушением фертильности.
Это указывает, во-первых, на волнообразное течениеактивного деметилирования которое проходит в два этапа: перед вступлениемсперматогониев в мейоз и после его завершения на стадии сперматид, а, во-вторых, – науниверсальность и запрограммированность этого процесса в сперматогенезе человека.Таким образом, специфические рисунки гидроксиметилирования и метилированияв родительских гаметах отличаются таковых в материнских и отцовских набораххромосом зиготы.
Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что формированиепаттерна гидроксиметилирования и метилирования в геноме зиготы происходит de novo.В зиготе же этот процесс начинается сразу после оплодотворения и строгозапрограммирован. В то же время, изменения специфичности распределения 5hmC всперматогенезе человека как строго запрограммированы в ходе дифференцировки, так имогут быть индуцированы внешними и/или внутренними факторами на завершающихстадиях спермиогенеза.4.3. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК метафазных хромосом дробящихсязародышей человека и на стадии бластоцистыНачиная со стадии трёх клеток на метафазных хроосомах эмбрионов человекаотмечается асимметричное распределение модифицированного цитозина.
Ранее сходныйтип распределения 5-метилцитозина был описан у ранних эмбрионов мышей и получилназвание гемиметилирование (Rougier et al., 1998). Гемиметилированное состояние можетдостигаться за счёт пассивного (зависимого от репликации) деметилирования ДНК, прикотором новосинтезированная цепь ДНК остаётся неметилированной (Howlett, Reik,1991). Вследствие этого после репликации каждая асимметрично метилированнаяхромосома состоит из двух хроматид, одна из которых содержит метилированную, адругая – неметилированную нить ДНК.
Также имеются данные об асимметричномраспределении 5hmC на хромосомах доимплантационных зародышей мышей: на стадиидвух клеток во всех хромосомах выявляли 5hmC только в одной хроматиде каждойхромосомы,однакоскаждымделениемдробленияколичествоасимметричногидроксиметилированных хромосом уменьшалось примерно в два раза. Эти наблюденияпозволили предположить, что потеря 5hmC происходит пассивно и зависит отрепликации, как это было ранее доказано для 5mC (Inoue, Zhang, 2011). Также было95установлено, что число хромосом, содержащих 5hmC, варьировало от бластомера кбластомеру.
Однако, суммарное число хроматид, обогащённых 5hmC, во всехбластомерах было близко к теоретически ожидаемому, подсчитанному по числу хроматидс 5hmC, наследуемых из зиготы (Inoue, Zhang, 2011).Выявленное в настоящем исследовании уменьшение в ходе последвательныхделенийдроблениячислаасимметричногидроксиметилированныххромосомиувеличение числа хромосом, характеризующихся одинаково слабым уровнем содержания5hmC на обеих хроматидах, свидетельствует в пользу того, что у зародышей человекапроисходят сходные процессы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
