Диссертация (1145832), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Механизмом, лежащим в основе этого процесса, являетсяпассивная – зависимая от репликации – потеря 5hmC, происходящая при каждом делениидробления (рис. 25). При делении клетки по одной сестринской хроматиде, обогащённой5hmC, уходит в каждую из дочерних клеток. Вновь синтезированная ДНК не содержит5hmC, и таким образом число хромосом, обогащённых 5hmC, уменьшается вдвое послекаждого клеточного цикла (Inoue, Zhang, 2011), при этом их абсолютное число (суммарново всех бластомерах) остается неизменным. При дальнейших делениях абсолютное числохроматид, обогащённых 5hmC, не изменяется, и они «рассеиваются» между клетокэмбриона.В результате сестринских хроматидных обменов (СХО) не вся хроматида, а лишьеё часть может быть гидроксиметилирована, что и наблюдали в настоящем исследовании(рис.
8). СХО – это обмен участками между сестринскими хроматидами одной хромосомы(Haber, 1992). На стадии двух бластомеров СХО ведёт к «арлекиновой» окраске хромосом– каждая хроматида гидроксиметилирована лишь частично, причём на другой хроматидегомологичныйучастокнеоказываетсягидроксиметилированным.Хроматиды,обогащённые 5hmC, при последующих делениях дробления расходятся в разные клетки, ихромосом с «арлекиновой» окраской не наблюдается. Как известно, СХО обнаруживаютсяв норме при делении клеток в тканях млекопитающих (Tucker et al., 1993). Процессобмена происходит спонтанно во время репликации ДНК путём гомологичнойрекомбинации между сестринскими хроматидами. Считается, что рекомбинация междусестринскими хроматидами ответственна за восстановление повреждений во времярепликации (Sonoda et al., 1999).
СХО считаются консервативным и безошибочнымпроцессом, и, как правило, генетическая информация при этом остаётся неизменной(Wilson, Thompson, 2007). Уровень СХО у доимплантационных эмбрионах повышен посравнению с более поздними стадиями эмбриогенеза и тканями взрослого организма(Patkin et al., 1994). Более того, высокий уровень СХО крайне важен для нормальногоразвития ранних эмбрионов (Tsuzuki et al., 1996; Patkin et al., 1998). Предполагают, что96увеличение числа СХО у ранних эмбрионов является результатом дифференциальногометилирования сестринских хроматид, что, в свою очередь, является результатомпостепенного деметилирования во время последовательных делений дробления (Patkin etal., 1997; Patkin, 2002).
Аналогична и наблюдаемая в настоящем исследовании картинагидроксиметилирования.Несмотря на то, что для 5mC также характерна зависимая от репликации потеря вовремя делений дробления, к стадии бластоцисты практически не сохраняетсягемиметилированных хромосом. Это связано с реметилированием и приобретениемхромосомами к стадии бластоцисты рисунка сегментоспецифичного распределения 5mC,сходного с таковым в соматических тканях (Pendina et al., 2011).
Это событие совпадает сначалом дифференцировки бластомеров зародыша на внутреннюю клеточную массу итрофэктодерму.Большойинтереспредставляетвопросодальнейшейсудьбегидроксиметилированных хроматид, выявляемых на стадии бластоцисты. По всейвидимости, сохранение на отдельных хроматидах 5hmC, вероятно, не препятствует началудифференцировки клеток. Возможно, эти хроматиды могут и в дальнейшем сохранятьунаследованные из зиготы маркеры активного деметилирования; при этом с каждымклеточным делением 5hmC всё сильнее «рассеивается» по клеткам. Можно такжепредположить, что образовавшийся на стадии зиготы 5hmC на определенном этапедифференцировки удаляется из хроматина с помощью ферментативных систем.Рисунок 25.
Пассивная потеря 5hmC в ходе делений дробления доимплантационногоразвития зародыша человека.97На стадии бластоцисты клетки делятся на два типа по характеру распределения5mC и 5hmC. В интерфазных ядрах клеток, которые преимущественно располагаются внаружном слое бластоцисты, было выявлено высокое содержание 5mC и низкоесодержание 5hmC в интерфазных ядрах. В ядрах клеток другого типа, которыепреимущественно располагаются во внутреннем слое бластоцисты, наблюдали обратнуюкартину: низкое содержание 5mC и высокое содержание 5hmC. Вероятно, такоеразделение связано с дифференцировкой клеток на ТЭ и клетки ВКМ.
Ранее висследованиях на эмбрионах человека было показано, что ДНК в клетках ТЭметилирована сильнее, чем в клетках ВКМ (Fulka et al., 2004). Это говорит в пользу того,что клетки с высоким содержанием 5mC и низким содержанием 5hmC, преимущественнорасполагающиеся в наружном слое бластоцисты, наиболее вероятно являются ТЭ.Гипометилированные клетки внутреннего слоя бластоцисты, предположительно ВКМ, –сильно гидроксиметилированы, что свидетельствует о высокой интенсивности процессаактивного деметилирования.
Поскольку клетки ВКМ дадут начало всем тканям зародыша,активация в них генов путем активного деметилирования имеет ключевое значениеименно в этот период эмбриогенеза.Таким образом, в геноме человека на доимплантационных стадиях развития быливыявлены 5mC и продукт его окисления – 5hmC. Их наличие связано с процессомактивного деметилирования, который необходим для репрограммирования геномазародыша и начала дифференцировки тканей. Деметилирование ДНК у зародышейчеловекапроисходитзасчётсочетаниянесколькихмеханизмов:пассивногодеметилирования с удалением 5mC после каждого цикла репликации, активного, собразованием 5hmC на стадии зиготы, и последующего его пассивного удаления. Однако,несмотря на зависимую от репликации потерю 5hmC, он является стабильнойэпигенетической модификацией генома дробящегося зародыша человека, так какобразовавшисьнастадиизиготы,5hmCсохраняетсянапротяжениивсегодоимплантационного развития вплоть до бластоцисты.Таким образом, в доимплантационном развитии человека при каждом делениидробленияпроисходятсущественныеизмененияхарактераметилированияигидроксиметилирования ДНК метафазных хромосом.
Последние связаны с глобальнымдеметилированием ДНК генома зародыша, необходимым для его репрограммирования идальнейшего начала тканевой дифференцировки.984.4. Распределение 5hmC и 5mC на метафазных хромосомах у эмбрионов человека насроке 5-12 недель развитияЯвление асимметричного гидроксиметилирования хромосом было также выявлено вэмбриональных и экстаэмбриональных тканях зародышей человека на сроке от 5 до 12недель развития.Распределение метилированной ДНК на метафазных хромосомах из клетокцитотрофобласта хориона и эмбрионального лёгкого имело чётко выраженнуюсегментную специфичность: 5mC был преимущественно локализован в R-сегментах игетерохроматиновых блоках хромосом 1, 9, 16 и Y. Такой тип распределения 5mC былхарактерен для всех хромосом на всех проанализированных метафазных пластинках, чтосогласуется с данными, ранее полученными в лаборатории (Баранов и др., 2005; Ефимова,2012).
Однако, в связи с методологическими особенностями анализа распределения 5hmCне удалось установить его чёткой сегментной специфичности. Была установленатенденция к преимущественной локализации гидроксиметилированной ДНК в DAPIнегативных сегментах метафазных хромосом (R-сегментах). 5hmC отсутствовал вгетерохроматиновых блоках хромосом 1, 9, 16, Y и в центромерных участках хромосом(рис.
24).Характергидроксиметилированияхромосомизэмбриональныхиэкстраэмбриональных тканей сходен с таковым у доимплантационных эмбрионов. Вовремя делений дробления эмбрионов происходит эпигенетическое репрограммированиегенома – стираются унаследованные паттерны метилирования и устанавливаются новыеспецифические на стадии бластоцисты (Arand et al., 2015; Marcho et al., 2015; Vasilyev etal., 2016). Гидроксиметилированные хромосомы зиготы пассивно теряют 5hmC во времярепликации, что приводит к появлению гемигидроксиметилированных хромосом. Припоследующих делениях дробления эмбриона гемигидроксиметилированные хромосомыпостепенно замещаются негидроксиметилированными из-за дальнейшей зависимой отрепликации потери 5hmC, что совпадает с потерей 5mC (Баранов и др., 2005; Inoue, Zhang,2011;Pendinaetal.,2011;Efimovaetal.,2015).Случайноераспределениегидроксиметилированных и негидроксиметилированных хроматид приводит к тому, чтохарактер гидроксиметилирования отличается между разными бластомерами, что былопоказано нами ранее (Efimova et al., 2015).Пассивная потеря 5hmC в бластомерах является невосполнимой, т.к.
не происходитгидроксиметилирования ДНК в течение всего периода доимплантационного развития(Inoue, Zhang, 2011; Efimova et al., 2015). Однако характер гидроксиметилированияхромосом в постимплантационных эмбриональных и экстраэмбриональных клетках99указываютнанелинейноеизменениеуровня5hmC.Сегментоспецифичнаяимежхромосомная гетерогенность распределения 5hmC, наблюдаемая в настоящемисследовании, может быть связана с задержкой в образовании 5hmC из вновьобразовавшегося 5mC. В отличие от 5mC, который образуется на новосинтезированнойцепи ДНК сразу после репликации, для образования 5hmC на той же вновьсинтезированной цепи требуется около 30 часов (Bachman et al., 2014). Таким образом,при активном делении клеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканей можетнаблюдатьсянеполноесохранениеуровнягидроксиметилирования.Дальнейшееслучайное распределение гидроксиметилированных хроматид после митотическихделений и сестринских хроматидных обменов приводит к асимметричному наследованию5hmC дочерними клетками и «хаотическому» гидроксиметилированию хромосом в ткани.Таким образом, образуется уникальный характер распределения 5hmC в каждой клетке.Внастоящемисследованиикаксимметрично,такиасимметричногидроксиметилированные хромосомы имеют сходный характер метилирования ДНК.Известно, что в зиготах мышей накопление 5hmC зависит от активности ДНКметилтрансфераз, в том числе от метилазы DNMT3a, осуществляющей метилирование denovo.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
