Диссертация (1145832)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ ИРЕПРОДУКТОЛОГИИ ИМ. Д.О.ОТТА»На правах рукописиТихонов Андрей ВладимировичХРОМОСОМНАЯ, КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬГИДРОКСИМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ПРОЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ИЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ПЕРИОДЫ РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКАСпециальность 03.02.07 – генетикаДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:член-корр.

РАН, з.д.н., д.м.н., профессор В.С. БарановСанкт-Петербург – 2018ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................ 5ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................... 6ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................... 121.1. Метилирование ДНК ..................................................................................................... 121.2.

Открытие 5-гидроксиметилцитозина ........................................................................ 161.3. Механизмы деметилирования ДHК............................................................................ 171.4.Динамикаизменений5-гидроксиметилцитозинаприэпигенетическомрепрограммировании генома млекопитающих............................................................... 221.5. Роль 5-гидроксиметилцитозина в регуляции экспрессии генов ...........................

261.6. Влияние внешних факторов на изменения характера метилирования игидроксиметилирования ДНК соматических и половых клеток ................................ 271.7. Сперматогенез человека ............................................................................................... 301.8. Оогенез человека ............................................................................................................

351.9. Доимплантационное развитие зародыша человека ................................................ 381.10. Постимплантационное развитие зародыша человека. Развитие хориона иорганов дыхательной системы ........................................................................................... 43ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ .....................................................................................

472.1. Материал исследования ................................................................................................ 472.2. Методы ............................................................................................................................. 492.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер изнеоплодотворившихся яйцеклеток, зигот и бластомеров доимплантационныхзародышей человека ......................................................................................................... 492.2.2.Приготовлениецитогенетическихпрепаратовизфрагментовтестикулярной ткани, ворсин хориона и фрагментов эмбриональных органов ..

492.2.3.Приготовлениегистологическихпрепаратовизбиоптататканейсеменника ............................................................................................................................ 502.2.4. Приготовление препаратов из образцов эякулята ...........................................

512.2.5. QFH-окрашивание цитогенетических препаратов яйцеклеток, зигот,бластомеровдоиплантационныхзародышейисперматогенныхклетокчеловека ............................................................................................................................... 512.2.6.Иммунофлуоресцентноеокрашиваниецитогенетическихигистологических препаратов с помощью антител к 5hmC и 5mC .......................... 522.2.7. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) .................................................... 5422.2.8. Анализ препаратов ..................................................................................................

552.2.9.Измерениеинтенсивностифлуоресцентногосигналапослеиммунофлуоресцентной детекции 5hmC и 5mC на препаратах............................... 552.2.10. Статистическая обработка результатов ........................................................... 56ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ........................................................................................................

583.1.Распределение5hmCи5mCвгеномезародышейчеловеканадоимплантационных стадиях развития ............................................................................ 583.1.1. Гидроксиметилирование и метилирование ДНК метафазных хромосомразнородительского происхождения на стадии зиготы ............................................. 583.1.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК метафазных хромосом дробящихсязародышей человека и на стадии бластоцисты ........................................................... 633.2.

Гидроксиметилирование и метилирование ДНК половых клеток человека .... 673.2.1. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК мейотических хромосом яйцеклетокчеловека ............................................................................................................................... 673.2.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК сперматозоидов человека ......................

693.2.3. Сопоставление содержания в экуляте сперматозоидов с 5hmC спараметрами спермограммы и с долей сперматозоидов с фрагментацией ДHК . 723.2.4. Становление рисунка гидроксиметилирования и метилирования ДНК всперматогенных клетках человека ................................................................................ 743.3. Анализ гидроксиметилирования и метилирования ДНК метафазных хромосому эмбрионов человека 5-12 недель развития ....................................................................

80ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................................................... 894.1. Метилирование и гидроксиметилирование ДНК метафазных хромосомразнородительского происхождения на стадии зиготы ................................................. 894.2. Стадиоспецифические изменения метилирования и гидроксиметилированияДНК в проэмбриональный период развития человека .................................................

914.3. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК метафазных хромосом дробящихсязародышей человека и на стадии бластоцисты ............................................................... 954.4. Распределение 5hmC и 5mC на метафазных хромосомах у эмбрионов человекана сроке 5-12 недель развития ............................................................................................

99ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................................... 102ВЫВОДЫ .................................................................................................................................. 104СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................................... 1063ПРИЛОЖЕНИЕ .......................................................................................................................

1284СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ5caC – 5-карбоксилцитозин5fC – 5-формилцитозин5mC – 5-метилцитозин5hmC – 5-гидроксиметилцитозин5hmU – 5-гидроксиметилeурацилАТ-5mС – антитела к 5-метилцитозинуАТ-5hmC – антитела 5-гидроксиметилцитозинуAcD – актиномицин DAID – цитидиновая дезаминаза, индуцируемая активацией (activation-induced cytidinedeaminase)APOBEC–каталитическийполипептидфермента,редактирующегом-РНКаполипопротеина B (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide)BER – эксцизионная репарация оснований (base excision repair)CpG – цитозин-гуаниновый динуклеотид (C – цитозин, G – гуанин, p – фосфодиэфирнаясвязь между этими нуклеотидами)DAPI – 4,6-диамино-2-фенилиндолDNMT – ДНК метилтрансфераза (DNA methyltransferase)FISH – флуоресцентная гибридизация in situMBD – метилцитозинсвязывающий домен (methylcytosine-CpG-binding domain)МеСР – метилцитозинсвязывающий белок (methylcytosine binding protein)QFH – Q-сегментация хромосом, выявляемая с помощью флуорохрома Хехст 33258(quinacrine fluorescence Hoechst)SMUG – селективная монофункциональная гликозилаза, действующая на урацилоднонитевой ДНК (single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase)TDG – тиминовая ДНК-гликозилазаАФК – активные формы кислородаВКМ – внутренняя клеточная массаППК – первичные половые клеткипре-ППК – предшественники первичных половых клетокТЭ – трофэктодермаФГА – фитогемагглютининЭКО – экстракорпоральное оплодотворение5ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследованияОнтогенез млекопитающих начинается с оплодотворения – слияния двухвысокоспециализированных клеток – ооцита и сперматозоида, в результате которогоформируется тотипотентная зигота.

В основе способности зиготы дать начало новомуорганизму с более чем 200-ми типами клеток лежит сложная и скоординированная работамеханизмов, регулирующих функции генома и устанавливающих специфические дляклеточных линий профили экспрессии генов. Ключевую роль в определении судьбыклеток играют эпигенетические модификации ДНК и белков хроматина (Nashun et al.,2015). Присоединение и удаление различных химических групп в определенных сайтахможеткакспособствовать,такипрепятствоватьсвязываниюсхроматиномтранскрипционных факторов, детерминируя таким образом его функционально активныеи инертные участки. За счёт специфического для каждой клеточной линии набораэпигенетическихмодификаций(эпигенетическогопаттерна)устанавливаютсяинаследуются в ряду клеточных делений определенные профили экспрессии генов.

Инымисловами, именно эпигенетические механизмы определяют где, как и когда должна бытьреализована генетическая информация (Dean, 2016).В отличие от генетической информации, одинаковой во всех клетках организма и внорме не претерпевающей изменений в онтогенезе, эпигеном является пластичной ивысокодинамичнойсистемой,подверженнойкакзапрограммированным,такиспонтанным изменениям. Так, в онтогенезе млекопитающих дважды – в гаметогенезе ираннем эмбриогенезе – происходит репрограммирование эпигенома: глобальныеизменения, во время которых стираются предсуществующие эпигенетические паттерны иустанавливаютсяновые(Reik,2007;Lange,Schneider,2010).Эти«волны»эпигенетического репрограммирования являются неотъемлемой частью программыразвития и обеспечивают непрерывность передачи генетической информации, делаявозможным переходы от высокоспециализированных гамет к тотипотентной зиготе, азатем от соматических клеток к половым.

В то же время, известно, что воздействие какэкзо-, так и эндогенных факторов способно приводить к спонтанному изменениюэпигенетических паттернов, и как следствие, нарушению профилей экспрессии генов(Jefferson et al., 2013). Очевидно, что в периоды эпигенетического репрограммированиягенома эффект от таких воздействий будет наиболее выраженным.К эпигенетическим изменениям хроматина относят модифицирование цитозинаДНК и посттрансляционные модификации гистоновых белков (Holmquist, Ashley, 2006).6Модификация гистоновых белков происходит за счет присоединения метильной,ацетильной или фосфатной групп к аминокислотным остаткам в N-терминальныхучастках гистонов (Luger et al., 1997; Li et al., 2018). Участие в процессе трёх химическихгрупп, а также возможность их присоединения к различным аминокислотным остаткам впределах одного белка-гистона формирует широкий спектр возможных модификаций,определяющих, так называемый, «гистоновый код» нуклеосомы.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации