Отзыв официального оппонента 2 (1145843)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

официального оппонента на работу А.В. Тихонова «хРОмосомнАя, клеточнАЯ и ткАневАя специфичность гидРОксиметилиРОвАния днк В пРОзмБРИОИАльный и эмБРЙОнАльный пеРНОды РАЭВития челОВекА», представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.07— генетика. Актуальность диссертационной работы А.В. Тихонова «Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека» не вызывает сомнений.

Одной из центральных проблем биологии развития является необходимость понять, почему, начиная с процессов оплодотворения, на протяжении всего эмбриогенеза и дальнейшего постнатального развития вплоть до смерти определенные клетки включают и выключают специфические гены. Как формируется многоклеточный организм с огромным количеством разнодифференцированных тканей и органов из одной оплодотворенной яйцеклетки? На многие вопросы пока нет конкретных ответов, но представленная диссертация А.В. Тихонова позволяет понять ряд важнейших эпигенетических процессов, происходящих в течение оогенеза, сперматогенеза, после оплодотворения и в раннем эмбриональном развитии человека.

Понятно, что дифференциальная экспрессия генов — это генетическая основа развития живых организмов, которая необходима для достижения и поддержания взрослых стадий. А процессы дифференцировки и межклеточных взаимодействий регулируют эмбриональную программу генной экспрессии, Важную роль при этом играют эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов, к которым относятся гетерохроматизация, преобразование гистонового кода, метилирование и деметилирование ДНК, интерференция РНК.

Как показали последние исследования, старение и многие заболевания также тесно связаны с наследуемыми в клеточных поколениях изменениями экспрессии генов. Процессы метилирования и деметилирования имеют волнообразный характер на протяжении всего онтогенеза, что хорошо показано в представленной диссертации. Важно отметить, что особенности метилирования часто наследуются в следующих поколениях. Достоверность научных результатов подтверждается большим объемом экспериментальных данных, документированных микрофотографиями, использованием многочисленных методических приемов с учетом правильной организации экспериментов, и применением современных методических подходов, таких как иммунофлуоресцентная детекция 56гпС (гидроксиметилирования ДНК) и 5гпС (метилирование цитозина), флуоресцентная гибридизация ~п з)то (РЬН).

Экспериментальные данные обработаны методами биологической статистики с использованием различных современных программных обеспечений и достоверны. Диссертация оформлена в соответствии с требованиями, предъявляемыми к диссертациям на соискание ученой степени кандидата наук, и включает в себя следующие разделы: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 129 страницах, содержит 4 таблицы, 25 рисунков. Во введении автор аргументировано представляет современные представления об эпигеноме как пластичной и динамичной системе, способной к запрограммированным и спонтанным изменениям.

Хотя автор довольно категорично утверждает, что генетическая информация одинакова во всех клетках организма на протяжении всего онтогенеза, в отличие от эпигенетической модификации генома, что с моей точки зрения не совсем так. Репрограммирование эпигенома происходит в гаметогенезе и раннем эмбриогенезе волнообразно, что является одним из важных механизмов удаления предсуществующие эпигенетические паттерны для установления новых. Важную роль в эпигенетических преобразованиях играют 5- метилцитозин и продукт его окисления гидросиметилцитозин, исполняющего роль деметилирования ДНК, необходимого для эпигенетического репрограммирования генома гамет и эмбрионов. Автор поставил основную цель исследования — изучить последовательные изменения особенностей гидроксиметилирования ДНК в период оогенеза, сперматогенеза, до - и постимплантационного эмбриогенеза человека.

В главе «ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР» Андре Владимирович в соответствии с названием диссертации дает подробную характеристику процессов метилирования и деметилирования как в процессе гаметогенеза, так и раннего эмбриогенеза. Интересен факт, что межаллельные различия в импринтированных генах вызваны метилированием ДНК, и возникают они в гаметогенезе (Паткин, 2008). Важно отметить, что процесс метилирования пассивно или активно обратим и часто реализуется после репликации ДНК.

Несмотря на то, что биологическая роль гидроксиметилирования еще недостаточно изучена, уже по данным литературы понятно, что в основе этого феномена лежит процесс деметилирования ДНК. Достаточно информативен раздел о влиянии внешних факторов на гаметогенез и эмбриогенез, при котором может возникнуть аберрантное метилирование, приводящее к нарушениям первичной дифференцировки клеток и другим постнатальным потологиям (уаоКе1а!., 2008). Достаточно подробно освещены процессы сперматогенеза и оогенеза, доимпдантационное и постимплантационное развитие зародыша человека.

Литературный обзор написан хорошим языком и полностью отражает изучаемую проблему. В Главе 2 вМАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ» очень подробно на 11 страницах представлены методы приготовления препаратов хромосом и интерфазных ядер из неоплодотворенных яйцеклеток, зигот и бластомеров доимплантационных зародышей человека, из фрагментов тестикулярной ткани, ворсин хориона и фрагментов эмбриональных органов, гистологических препаратов из биоптата тканей семенника, из образцов эякулята.

Было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание цитогенетических и гистологических препаратов с помощью антител к 5ЬпС и 5гпС с целью определения плоидности интерфазных ядер на препаратах проводили флуоресцентную гибридизацию !и з!Ш (Р!5Н). Анализ препаратов и получение фотоизображений проводили с использованием флуоресцентных микроскопов. Детально было исследовано измерение интенсивности флуоресцентного сигнала после иммунофлуоресцентной детекции 5ЬпС и 5гпС на метафазных хромосомах зигот на цифровых фотоизображениях с помощью программы !гпа8е ! 1.49и. Убедительно была проведена статистическая обработка данных с помощью программ Мат)зиса 8,0 и бгарЬРадРг!згп 6.01.

Единственное замечание, что при культивировании яйцеклеток и доимплантационных зародышей не указано название питательной среды. Глава 3 кРЕЗУЛЬТАТЫ» содержит 3 основных подраздела, характеризующих распределение 5ЬпС и 5гпС в геноме предимплантационных зародышей человека, в половых клетках и у эмбрионов 5-12 недель развития. Такая последовательность изучения процессов метилирования и деметилирования, как оказалось, имеет свою логику. Распределение 5йтС и 5тС в геноме зародышей человека на доимплантационных стадиях развития. Исследования были проведены на зиготах, бластомерах, трехклеточных, 5-, 8-клеточных зародышей и на бластоцистах. Самая интересная стадия — зигота, поэтому остановлюсь на ней подробнее. Через 2-3 часа после оплодотворения в зиготе начинаются сложнейшие преобразования как в мужском, так и в женском пронуклеусах.

На метафазных хромосомах зигот диссертант исследовал распределение иммунофлуоресцентной детекции с помощью специфичных антител к гидроксиметилированному и метилированному цитозину. Были получены интересные результаты по особенностям гипергидроксиметилирования и гипометилированния хромосом материнского и отцовского происхождения, Я когда-то занималась изучением синтеза ДНК в зиготах кролика.

Мы показали, что ДНК-репликативные процессы функционально связаны морфологическими изменениями в пронуклеусвх кролика. В начале 5-фазы мужской пронуклеус обладает более сильно выраженной репликативной активностью, а во второй половине 5-периода мужской пронуклеус становится больше женского, но интенсивность синтеза ДНК затухает. Мы выявили два типа хроматина, отличающиеся по времени репликации ДНК.

В этой связи было бы интересно посмотреть процессы репрограммирования генома не только в хромосомах, но и в пронуклеусах на разных временных этапах. Автор получил интересные данные о сегментоспецифичном распределении 5йгпС в хромосомах, а главное — хромосомы отцовского происхождения гипергидроксиметилированы и гипометилированы по сравнению с хромосомами материнского происхождения. В процессе дробления, уже со стадии трех бластомеров начинается ассиметричное постепенно затухающее распределение 56тС, что отчасти, по мнению диссертанта, связано с сестринскими хроматидными обменами и репликационными процессами. Первая дифференцировка клеток проходит в бластоцисте и диссертант показал, что высокое содержание 5пгпС локализовано в ядрах клеток внутренней клеточной массы, дающей начало развитию эмбриона, что косвенно может указывать о связи процессов метилирования и гидроксиметилирования с первичной дифференцировкой клеток в эмбриогенезе. Гидроксиметилирование и метилирование ДНК половых клеток человека.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации