Диссертация (1145832), страница 19
Текст из файла (страница 19)
G – идиограмма (ISCN, 2016).Красным цветом указаны R-сегменты.Таким образом, в отличие от стабильного характера метилирования ДНК,распределение 5hmC на метафазных хромосомах из клеток эмбриональных иэкстраэмбриональныхмежклеточнойкомбинациямиитканеймежтканевойхарактеризуетсявыраженнойвариабельностью,гидроксиметилированных,межхромосомной,обусловленнойразличнымигемигидроксиметилированныхинегидроксиметилированных хромосом.88ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕОсновную роль в дифференциальной экспрессии генов в индивидуальном развитиичеловека принадлежит эпигенетическим маркерам, которые устанавливаются в ходеэмбрионального развития и обеспечивают репрограммирование генома. Эпигенетическоерепрограммирование заключается в удалении старых эпигенетических модификаций иустановления новых, специфичных для каждой ткани и конкретного периода онтогенеза.Основные эпигенетические изменения, определяющие репрограммирование генома, умлекопитающих и человека происходят в процессе гаметогенеза и во время деленийдробленияоплодотвореннойяйцеклетки,атакжевпериодпоследующейдифференцировки эмбриональных органов и тканей (Reik, 2007; Lange, Schneider, 2010).Основнымимаркерамиэтихпроцессоввыступают5-метилцитозиниегокислородсодержащие формы, образующиеся в результате ферментативных реакцийокисления.4.1.МетилированиеигидроксиметилированиеДНКметафазныххромосомразнородительского происхождения на стадии зиготыВнастоящейработебылпроанализированстатусметилированияигидроксиметилирования метафазных хромосом на стадии зиготы, в результате которогобыли выявлены различия в рисунке эпигенетических маркеров на хромосомахразнородительского происхождения.
Так, установлено, что наборы хромосом отцовскогопроисхождения были гипергидроксиметилированы и гипометилированы. В набораххромосом материнского происхождения наблюдали контрастную картину: они былигипогидроксиметилированы и гиперметилированы. Таким образом, наиболее вероятно,чтогенетическийматериал,унаследованныйототца,подвергаетсяактивномудеметилированию. Процесс активного деметилирования может проходить несколькимипутями. Один из них – гидроксилирование 5mC белками семейства TET с образованиемпромежуточного соединения – 5hmC (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010). Ранее в работахпо изучению активного деметилирования в зиготах млекопитающих был показан высокийуровень содержания 5hmC в мужских пронуклеусах у мышей, коров и кроликов, чтосвидетельствует в пользу ТЕТ-опосредованного деметилирования (Iqbal et al., 2011;Wossidlo et al., 2011; Zhang et al., 2012; Amouroux et al., 2016).
Выявленный в настоящемисследованиивысокийуровеньгидроксиметилированияхромосомотцовскогопроисхождения свидетельствует о том, что в зиготах человека также происходит активноедеметилирование хромосом отцовского происхождения с образованием 5hmC. Таким89образом, можно предположить, что у млекопитающих активное деметилирование собразованием5hmCявляетсяуниверсальнымиэволюционноконсервативныммеханизмом.Обращает на себя внимание тот факт, что 5hmC также был выявлен и в хромосомахматеринскогопроисхождения.Однако,степеньобогащённостихроматина5-гидроксиметилцитозином в них была значительно ниже, чем в хромосомах отцовскогопроисхождения. Многочисленные данные об изменении уровня метилирования ДНК вгеноме зигот модельных объектов свидетельствуют в пользу того, что женский геном неподвергается активному деметилированию (Iqbаl et al., 2011; Wоssidlо еt аl., 2011; Zhаng etal., 2012).
Однако, результаты, полученные в настоящем исследовании, позволяютговорить о том, что у человека на стадии зиготы процесс активного деметилированияхарактерен для обоих пронуклеусов, но в хромосомах отцовского происхожденияпроходит более интенсивно, чем в материнских. Таким образом, процесс активногодеметилирования имеет определенную видоспецифичность.В настоящем исследовании впервые описано явление сегментоспецифичнойлокализации 5hmC на хромосомах.
Известно, что для R- и G-сегментов характерен разныйнуклеотидный состав: R-сегменты обогащены GC-парами, в то время как G-сегменты –АТ-парами (Родионов, 1985; Sumner, 1990). R-сегменты содержат больше генов, чем Gсегменты – около 80% (Musio et al., 2002). В составе R-сегментов выделяют участкинаиболее богатые СрG-динуклеотидами – Т-сегменты. Т-сегменты наиболее устойчивы квоздействиям температуры и отличаются самой высокой плотностью генов по сравнениюс другими сегментами хромосом (Folle et al., 2013). Для R- и G-сегментов характернаразная степень компактизации хроматина.
Высокая степень компактизации являетсяхарактерной чертой G-сегментов, а в R-сегментах преимущественно расположены слабокомпактизованные участки (Gilbert et al., 2004). Полученные в настоящем исследованиирезультаты свидетельствуют о том, что не все участки хромосом подвержены активномудеметилированию в равной степени в зиготе: этот процесс проходит более интенсивно вбогатых генами R-сегментах.В свою очередь, при анализе распределения 5mC на хромосомах зигот не быловыявлено сегментоспецифичности метилирования. 5mC располагался по длине хромосомпрактически равномерно. Различия в интенсивности флуоресценции районов хромосомбыли незначительны, а границы локализации сигналов с большей и меньшейинтенсивностью были нечёткими и, таким образом, не позволили определить сегментнуюспецифичность сигнала, что хорошо согласуется с полученными ранее данными (Pendinaet al., 2011).
Выявленный феномен вызывает удивление, поскольку GC-богатые R90сегменты по сравнению с G-сегментами потенциально несут больше сайтов, которыемогут подвергаться метилированию (Wright et al., 2001). Кроме того, в метафазныххромосомах из соматических клеток, в частности из лимфоцитов взрослого человека и изклеток эмбриональных тканей, распределение 5mC вдоль плеч хромосом коррелирует сплотностью СрG-динуклеотидов в сегментах хромосом (Barbin et al., 1994; Kokalj-Vokac etal., 1998; Баранов и др., 2005; Пендина и др., 2005; Pfarr et al., 2005). С учётомобнаруженной нами на метафазных хромосомах зигот сегментоспецифичной локализации5hmC, можно предположить, что появлению такого рисунка гидроксиметилированияпредшествовало сегментоспецифическое метилирование ДНК на хромосомах.
Призапуске механизма активного деметилирования расположенный преимущественно в Rсегментах хромосом 5mC был преобразован в 5hmC ферментативными системами, что ипривело к гомогенному распределению метилированной ДНК на хромосомах исегментоспецифичной локализации гидроксиметилированной ДНК. Метилированныйцитозин может не только регулировать активность генов (Straussman et al, 2009), но ивыполнять структурную функцию (Hendrich, Bird, 1998; Reik et al., 2001). В то же времявероятно,5hmC,участвуеттольковрегуляцииэкспрессиигенов,таккакгидроксиметилированию подвергаются исключительно R-сегменты.
Возможно, этосвязано с подготовкой к будущей активации эмбрионального генома.Такимобразом,длягеноматриплоиднойзиготычеловекахарактерносегментоспецифичное распределение 5hmC и практически гомогенное распределение5mC на метафазных хромосомах. Хромосомы разнородительского происхождения имеютсобственный уникальный характер распределения 5hmC и 5mC.Однако, остаётся неясным вопрос, на каком этапе происходит установлениерисунка метилирования и гидроксиметилирования, характерное для метафазныххромосом зигот: наследуется он из гамет или устанавливается de novo послеоплодотворения.
Ответ на этот вопрос, в определённой степени, может дать анализраспределения модифицированного цитозина в геномах женских и мужских половыхклеток.4.2. Стадиоспецифические изменения метилирования и гидроксиметилированияДНК в проэмбриональный период развития человекаВнастоящейработеустановлено,чтонастадиизиготыхромосомы,унаследованные от отца гидроксиметилированы сильнее по сравнению с хромосомамиматеринскогопроисхождения.Вероятно,формированиеконтрастногорисункагидроксиметилирования хромосом разнородительского происхождения в зиготе может91устанавливаться ещё в гаметах и наследоваться и/или формироваться непосредственнопосле оплодотворения в зиготе благодаря работе белков семейства TET. Для проверкиэтогопредположениябылпроведёнанализсодержания5hmCи5mCвнеоплодотворившихся яйцеклетках и эякулированных сперматозоидах.В неоплодотворившихся яйцеклетках были выявленыи 5hmC, и 5mC-метилцитозин.
Наличие сигнала 5hmC может свидетельствовать о запуске механизмаактивного деметилирования в геноме яйцеклетки. Однако, предполагают, что умлекопитающих активное деметилирование начинается только после слияния гамет – взиготе, и затрагивает преимущественно отцовский геном (Iqbal et al., 2011; Wossidlo et al.,2011; Amouroux et al., 2016). Поэтому наличие в яйцеклетках гидроксиметилированнойДНК, выявленной в настоящей работе, может свидетельствовать о нарушенииэпигенетической реорганизации генома яйцеклетки и быть причиной её неспособности коплодотворению.
С другой стороны, гидроксиметилирование ДНК может бытьследствием того, что в яйцеклетке уже запущены процессы, специфичные для стадиизиготы, несмотря на отсутствие мужского генома. Не исключено, что 5hmC может иметьсобственныефункциивяйцеклеткенаданномэтаперазвития.Поэтомугидроксиметилирование ДНК яйцеклетки не обязательно свидетельствует о нарушениипрограммы развития.В процессе дифференциации первичных половых клеток в зрелые гаметыформируется уникальный набор эпигенетических маркеров сперматозоидов человека.Наиболее значимыми эпигенетическими событиями при созревании сперматогониев дозрелых сперматозоидов, являются метилирование и деметилирование ДНК.В настоящем исследовании во всех сперматозоидах здоровых доноров былобнаружен 5mC.
В то же время 5hmC присутствовал лишь в единичных сперматозоидах.Присутствие в эякуляте доноров лишь небольшого числа сперматозоидов с высокимсодержанием 5hmC и почти полное его отсутствие в подавляющем большинстве гаметвызывает вопрос о роли гидроксиметилированных сперматозоидов: являются ли онианомалией или, напротив, именно они способны к оплодотворению и инициациипрограммы нормального эмбрионального развития. Для ответа на этот вопрос былаисследована группа пациентов с нарушением фертильности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
