Диссертация (1145832), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Однако, отмечена тенденция к локализации 5hmC в QFHнегативных сегментах.Следует отметить, что на хромосомах как отцовского, так и материнскогопроисхождения максимальная интенсивность флуоресценции АТ-5hmC отмечена втеломерныхрайонахоколоцентромерныххромосомучастках(в348хромосомизкак462хромосом;отцовского75,32±2,01%).происходжения,такВиматеринского, включая самые большие гетерохроматиновые блоки 1q12, 9q12, 16q11.2 и61Yq12 5hmC не обнаружен (рис. 6).
Такой характер распределения 5hmC повторялся навсех фрагментах метафазных пластинок. Таким образом, для 5hmC характернаспецифичная локализация в R- и, особенно, Т-сегментах, но не в прицентромерномгетерохроматине (C-сегменты) в хромосомах на стадии зиготы.При анализе метилирования ДНК в сильно гидроксиметилированных (отцовских)наборах хромосом, наблюдали слабо выраженный дифференциальный рисунок. Болеевысокий уровень метилирования отмечался только в теломерных участках. В слабогидроксиметилированных(материнских)набораххромосомтенденциякпреимущественной локализации 5mC в R-сегментах была более выражена (рис.
6). Всеоколоцентромерные участки, включая 1q12, 9q12, 16q11.2, были слабо метилированы илисовсем не содержали 5mC, не зависимо от их родительского происхождения (рис. 6).Рисунок 6. Совмещённая кариограмма хромосом 1, 9, 16 из наборов отцовского иматеринского происхождения триплоидной зиготы после QFH/AcD-окрашивания ииммунофлуоресцентного окрашивание с помощью антител к 5hmC (флуорохром Alexa488) и 5mC (флуорохром Cy3). Стрелками указаны R-сегменты хромосом, обогащенные5hmC (идиограмма, ISCN, 2016). Синим цветом отмечены гетерохроматиновые блоки1q12, 9q12, 16q11.2.Таким образом, для триплоидной зиготы человека является характернымсегментоспецифичное распределение 5hmCв метафазных хромосомах–5hmCлокализован в R- и, особенно, Т-сегментах, но не в C-сегментах.
Для 5mC сегментнаяспецифичность распределения не столь ярко выражена, но прослеживается тенденция клокализации сигнала в R-сегментах. Хромосомы разнородительского происхожденияотличаются по характеру распределения 5mC и 5hmC: хромосомы отцовского62происхождения гипергидроксиметилированы и гипометилированы по сравнению схромосомами материнского происхождения.3.1.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК метафазных хромосом дробящихсязародышей человека и на стадии бластоцистыИз-затруднодоступностидоимплантационныхэмбрионовчеловекадляисследования, в анализ не были включены бластомеры двухклеточных эмбрионов,находящихся на стадии метафазы второго деления дробления. Был проанализированхарактера гидроксиметилирования метафазных хромосом из бластомеров трёхклеточныхэмбрионов. Был учтён тот факт, что один из трёх анализируемых бластомеров находилсяна стадии метафазы второго деления дробления, а два – на стадии метафазы третьегоделения дробления.При анализе рисунка метилирования метафазных хромосом из бластомеровтрёхклеточных зародышей человека (n=4) были выявлены отличия в характерераспределения 5hmC по сравнению с таковыми на стадии зиготы.
Прежде всего былизарегистрированыхромосомысасимметричнымраспределениемгидроксиметилированной ДНК, в которых яркий сигнал 5hmC присутствовал только наодной хроматиде, а другая хроматида была гидроксиметилирована слабо. Интересноотметить, что в некоторых хромосомах яркий сигнал был зарегистрирован не по всейдлине хроматиды, а только на части одной из хроматид (рис. 7). Описанный характерраспределения сайтов связывания АТ-5hmC наблюдали в большинстве хромосом(76,4±3,8%)избластомеровтрёхклеточныхзародышей.Приэтомслабогидроксиметилированная хроматида была метилирована в меньше степени, чем другая. Вхроматидах с низким содержанием 5hmC наблюдали сегментоспецифичную локализациюсигнала, не отличающуюся от таковой на стадии зиготы.63Рисунок 7.
Метафазные хромосомы из бластомеров трёхклеточного зародыша, 5клеточного зародыша, 8-клеточного зародыша и бластоцисты. QFH/AcD-окрашивание(QFH), иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител к 5hmC (флуорохромAlexa 488), иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител к 5mC (флуорохромAlexa 555), совмещённое изображение, и отдельных хромосомы из представленныхметафазных пластинок.Необходимо учитывать особенность бластомеров трёхклеточного эмбриона: два изтрёх анализируемых бластомеров находились на стадии метафазы третьего делениядробления, а один – на стадии метафазы второго деления дробления. Соответственно,если предполагать зависимую от репликации потерю 5hmC, то на стадии трёх клеток, водном неразделившемся бластомере, теоретически, одна хроматида каждой хромосомыдолжна нести 5hmC, а в двух других бластомерах – 50% хромосом должны нести по одной64гидроксиметилированной хроматиде.
Таким образом, на стадии трёхклеточного зародышасодержать 5hmC в одной из хроматид должны две трети хромосом из трёх бластомеров,что близко к результату, который получен в настоящем исследовании – 76,4±3,8%.Было проанализировано число ассиметрично гидроксиметилированных хромосом вполных метафазах и фрагментах метафазных пластинок (n=95) из 61 эмбриона оттрёхклеточной стадии до стадии бластоцисты (табл. 2).
С трёхклеточной стадии до стадиибластоцисты число хромосом, у которых гидроксиметилирована только одна хроматида,уменьшилось. Они составляли 76,4±3,8% на стадии 3-х бластомеров, 40,7±2,9% на стадии4-5 бластомеров, 14,2±2,0% на стадии 7-бластомеров-морулы и 6,5±0,5% на стадиибластоцисты, тогда как остальные хромосомы были негидроксиметилированы (табл. 2).Число асимметрично метилированных хромосом примерно соответствовало числуасимметрично гидроксиметилированных хромосом и составляло 59,2 ±4,5% на стадии 3-хбластомеров, 33,4±2,9% на стадии 4-5 бластомеров, 17,3±1,2% на стадии 7-бластомеровморулы и 6,6±0,5% на стадии бластоцисты (табл.
2).Таблица 2. Доля асимметрично гидроксиметилированных и метилированных хромосом вяйцеклетках, зиготах и доимплантационных зародышах человека.КоличествоСтадияКоличестворазвитияобразцовметафазныхпластинок иихДоля хромосом сКоличествоасимметричнымсигналомхромосомфрагментов5hmC5mCЯйцеклетка19194860+0,2%0+0,2%Зигота20206690+0,2%0+0,2%3 клетки4412376,4±3,8%59,2±4,5%4-5 клеток51027540,7±2,9%33,4±2,9%7 клеток-морула151636814,2±2,0%17,3±1,2%Бластоциста376522716,5±0,5%6,6±0,5%Таким образом, на всех проанализированных стадиях доимплантационногоразвитиязаисключениемзиготынаблюдалихромосомысасимметричнымраспределением сигнала АТ-5hmC. И число таких хромосом уменьшалось в ходе деленийдробления.Приэтомдоляасимметричнометилированныххромосомбыла65приблизительно равна доле асимметрично гидроксиметилированных хромосом на каждойиз исследованных стадий развития.
Следовательно, деления дробления у человекасопровождаются одновременным уменьшением уровня 5hmC и 5mC. Таким образом,полученные результаты свидетельствуют о потере как 5mC, так и 5hmC зависимым отрепликации способом у доимплантационных зародышей человека.Интересен тот факт, что на некоторых асимметрично гидроксиметилированныххромосомах зародышей разных стадий доимплантационного развития 5hmC был выявленне по всей длине хроматиды, а только на части (рис. 8). Причиной этого явления могутбыть сестринские хроматидные обмены (СХО). На стадии трёх бластомеров СХОприводили к «арлекиновой» окраске хромосом АТ-5hmC – каждая хроматидаокрашивалась лишь частично, причем на другой хроматиде гомологичный окрашенномуучасток не нёс сигнала АТ-5hmC (рис. 8). Это можно объяснить тем, что один из трёхбластомеров зародыша ещё не разделился. Хроматиды, обогащённые 5hmC, припоследующих делениях дробления расходятся в разные клетки, и хромосом с«арлекиновой» окраской не наблюдается.Рисунок 8. Метафазные хромосомы из бластомеров 3-клеточного, 5-клеточного, 8клеточного эмбриона и бластоцисты.
QFH/AcD-окрашивание и иммунофлуоресцентноеокрашивание с помощью антител к 5hmC (флуорохром Alexa 488) и 5mC (флуорохромAlexa 555).Обращает на себя внимание отсутствие 5hmC и 5mC в гетерохроматиновых блокаххромосом на всех проанализированных стадиях развития – от зиготы до бластоцисты.66На стадии бластоцисты было выявлено два типа бластомеров по характеруокрашивания антителами к 5hmC и 5mC. В ядрах бластомеров, которые располагаютсяпреимущественно в наружном слое бластоцисты, было выявлено низкое содержание5hmC и высокое содержание 5mC. В ядрах клеток другого типа, которые лежатпреимущественно во внутреннем слое бластоцисты, наблюдали обратную картину: низкоесодержание 5mC и высокое содержание 5hmC (рис.
9).Рисунок 9. Ядра клеток на стадии бластоцисты после окрашивания флуорохромом DAPI ииммунофлуоресцентного окрашивания специфическими антителами к 5mC (флуорохромAlexa 555) и 5hmC (флуорохром Alexa 488).Таким образом, при каждом делении дробления в доимплантационном развитиичеловека происходят существенные изменения характера гидроксиметилирования иметилированияДНКметафазныххромосом,повсейвидимости,связанныесрепрограммированием генома и подготовкой клеток к дальнейшей дифференцировке.Остаётся неясным вопрос, на каком этапе происходит установление рисункагидроксиметилирования и метилирования ДНК, наблюдаемого в настоящем исследованиина стадии зиготы: наследуется ли он из гамет или устанавливается de novo послеоплодотворения. Для ответа на этот вопрос были проанализированы характергидроксиметилирования и метилирования ДНК в гаметогенезе человека.3.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
