Диссертация (1145832), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Гидроксиметилирование и метилирование ДНК половых клеток человека3.2.1. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК мейотических хромосом яйцеклетокчеловекаНеоплодотворившиеся яйцеклетки человека анализировали на стадии метафазывторого деления мейоза (стадия MII). Были проанализированы хромосомы из 1967яйцеклеток.
При иммунофлуоресцентном анализе было выявлено неравномерноераспределение сигналов 5hmC и 5mC по длине хромосом. Сигнал АТ-5hmC и АТ-5mCприсутствовал в плечах всех проанализированных хромосом из яйцеклеток. Однако, 5hmCи 5mC не были выявлены в центромерах и околоцентромерных районах (рис. 10).Распределение 5hmC и 5mC не отличалось в разных яйцеклетках.Рисунок 10.
Метафазные хромосомы из неоплодотворившейся яйцеклетки. А –иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител к 5hmC (флуорохром Alexa488). Б – иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител к 5mC (флуорохромAlexa 555). В – QFH/AcD-окрашивание. Г – совмещенное изображение.Таким образом, характер гидроксиметилирования и метилирования хромосомяйцеклеток отличается от такового в хромосомах материнского происхождения на стадиизиготы.683.2.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК сперматозоидов человекаПроведён анализ содержания 5hmC и 5mC в сперматозоидах из образцов эякулятаот 13 доноров спермы.
Детекцию 5hmC и 5mC на фиксированных препаратахсперматозоидов проводили методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью антителк 5hmC и 5mC. Содержание 5hmC и 5mC оценивали качественно по наличию илиотсутствию иммунофлуоресцентного сигнала.В ходе настоящего исследования на фиксированных препаратах из эякулятов былопроанализировано по 5000 сперматозоидов каждого из 13 доноров. Во всех сперматозоидхбыл выявлен 5mС (рис.
11, А – Г), причем наблюдалась лишь небольшая вариабельностьинтенсивности флуоресценции между отдельными сперматозоидами. В отличие от 5mC,5hmС в большинстве сперматозоидов практически отсутствовал и был выявлен лишь вединичныхсперматозоидах.Былаустановленадолягидроксиметилированныхсперматозоидов в проанализированных образцах путём подсчёта 5hmC-положительныхсперматозоидов среди 5000 сперматозоидов в образце эякулята от каждого из 13 доноровспермы.Долясперматозоидов,содержащих5hmС,характеризоваласьмежиндивидуальной вариабельностью и составила у доноров спермы от 0,02% до 0,46%.Для дальнейшего изучения феномена избирательного гидроксиметилированиясперматозоидов человека, было проанализировано содержание 5hmC-положительныхсперматозоидов в образцах эякулята 37 пациентов из бесплодных пар.
Согласно критериюВсемирной организации здравоохранения, бесплодной является пара, в которойбеременность не наступает в течение года при регулярной половой жизни безконтрацепции. В эту группу входили пациенты с диагнозами нормозооспермия,астенозооспермия и тератозооспермия.69Рисунок 11. Сперматозоиды из эякулятов доноров (А – Г) и пациентов из бесплодных пар(Д – З): А, Д – иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител к 5hmC(флуорохром Alexa 488); Б, Е – иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антителк 5mC (флуорохром Alexa 555); В, Ж – совмещённое изображение после окрашивания спомощью антител к 5hmC (флуорохром Alexa 488), к 5mC (флуорохром Alexa 555) иDAPI; Г, З – фазово-контрастная микроскопия.В образцах эякулята каждого из пациентов было проанализировано по 5000сперматозоидов.
Также, как и в эякуляте доноров спермы, 5hmС был выявлен у всехпациентов лишь в отдельных сперматозоидах (рис. 11, Д – З). Однако, у пациентов избесплодных пар доля сперматозоидов, которые содержат 5hmС, была значительно выше,чем у доноров спермы и варьировала в более широких пределах: 0,12-21,24% против 0,020,46% (Р<0,0001) (рис.
12). Размах варьирования доли гидроксиметилированныхсперматозоидов у пациентов в 48 раз превышает таковой у доноров спермы. Припопарномсравненииподгрупппациентовсдиагнозаминормозооспермия,астенозооспермия и тератозооспермия достоверных различий между ними выявлено небыло.
Таким образом, повышенное содержание сперматозоидов с 5hmС в эякулятепациентов с нарушением фертильности и низкое содержание таковых у доноров спермыможет указывать на связь гидроксиметилирования ДНК мужских гамет с нарушениямирепродуктивной функции.70Картина распределения 5mC в сперматозоидах пациентов была идентична таковойвсперматозоидахдоноров:5mСбылвыявленвовсехпроанализированныхсперматозоидах (рис. 11). Интенсивность флуоресценции 5mC была выше в 5hmCположительных сперматозоидах (P<0,0001) (рис.
13).Рисунок 12. Распределение содержания сперматозоидов с 5hmC у пациентов снарушением фертильности и у доноров (P<0,0001, U-критерий Манна-Уитни).Рисунок 13. Количественный анализ интенсивности флуоресценции АТ-5hmC и АТ-5mC всперматозоидах 3 индивидуумов (A, Б, B). Интенсивность флуоресценции АТ-5hmC и АТ5mCразличаетсямежду5hmC-положительнымии5hmC-отрицательнымисперматозоидами (P<0,0001, U-критерий Манна-Уитни).71Таким образом, по всей видимости, увеличение уровня 5-гидроксиметилцитозина вотдельных сперматозоидах является скорее вариантом патологии, чем нормой.Полученные результаты указывают, что как в женских, так и в мужских гаметахнормальный характер распределения 5hmC и 5mC отличается от такового в материнских иотцовских наборах хромосом в зиготе.
Это свидетельствует в пользу того, чтонаблюдаемый на стадии зиготы паттерн гидроксиметилирования и метилирования ДНКформируется de novo после оплодотворения и его формирование является начальнымэтапом эпигенетическоо репрограммирования генома доимлантационного зародыша.3.2.3. Сопоставление содержания в экуляте сперматозоидов с 5hmC с параметрамиспермограммы и с долей сперматозоидов с фрагментацией ДHКС учётом того, что доля сперматозоидов с 5hmC в эякуляте доноров и, особенно,пациентов из бесплодных пар сильно варьирует, актуальным представлялось сопоставитьэтотпараметрсразличнымипоказателямиспермограммы.Спермограмма(спермиологический анализ) представляет собой анализ эякулята, проводимый длявыявления нарушений сперматогенеза и оценки мужской фертильности.
При проведенииспермиологического анализа оценивают качественные и количественные характеристикиэякулята: число сперматозоидов, их подвижность, морфологические характеристики,вязкость эякулята, pH (WHO, 2010).Была проанализирована взаимосвязь между содержанием в эякуляте 5hmCположительных сперматозоидов и такими параметрами спермограммы, как концентрация,подвижность и морфология сперматозоидов, включая морфологию головки, аномалиихвоста и шейки. Данные спермиологического анализа пациентов и доноров спермы былипредоставлены отделением вспомогательных репродуктивных технологий НИИ АГиРим.Д.О.Отта (табл. 3).
Оценку взаимосвязи проводили с помощью вычислениякоэффициента корреляции по Спирмену. Была обнаружена сильная отрицательнаякорреляция с частотой морфологически нормальных сперматозоидов (r=-0,567, P<0,0001)и сперматозоидов с нормальной головкой (r=-0,609, P<0,0001). Также была обнаруженаслабая положительная корреляция между долей сперматозоидов с 5hmC и долейнепрогрессивно-подвижныхсперматозоидов(r=0,346,P=0,014)иподвижныхсперматозоидов (r=0,317, P=0,025). Коэффициент корреляции Спирмена, описывающийвзаимосвязьмеждудолей5hmC-положительныхсперматозоидовиостальнымипараметрами спермограммы был не достоверен: для концентрации сперматозоидов(r=0,077, P=0,595), доли прогрессивно-подвижных сперматозоидов (r=-0,192, P=0,183),72доли сперматозоидов с аномальным хвостом (r=0,142, P=0,327) и доли сперматозоидов саномальной шейкой (r=-0,157, P=0,276) (рис.
14).Таблица 3. Характеристика эякулята доноров спермы и пациентов из бесплодных пар.Данные спермиологического анализа указаны как среднее (минимум-максимум). PзначениярассчитанысиспользованиемU-критерияМанна-Уитни.P-значения,показывающие статистически значимое различие между группами, обозначены *.Параметры спермыДоноры спермыПациенты из(n=13)бесплодных парP-значение(n=37)Концентрация (×106/мл)118,30 (64-191)128,10 (2-340)0,9434Подвижность (%)86,15 (65-100)87,92 (47-100)0,5623Прогрессирующая68,85 (49-90)57,00 (17-88)0,0487*17,31 (3-38)30,92 (1-83)0,1472Нормальная морфология (%)12,69 (6-24)5,95 (0-22)0,0003*Нормальная головка (%)13,62 (5-24)4,24 (0-25)<0,0001*Аномальная морфология (%)67,00 (28-94)90,68 (73-100)<0,0001*Аномальная головка (%)74,08 (52-92)85,97 (68-100)0,0008*Аномальный хвост (%)1,54 (0-10)1,24 (0-11)0,3751Аномальная шейка (%)5,54 (0-22)3,46 (0-12)0,62подвижность (%)Непрогрессирующаяподвижность (%)Помимо спермиологического анализа для оценки качества эякулята все ширеиспользуется метод оценки целостности ДНК сперматозоидов.
Была проанализированавзаимосвязь между содержанием в эякуляте гидроксиметилированных сперматозоидов исперматозоидов с фрагментированной ДНК. Фрагментацию ДHК оценивали методомTUNEL (Теrminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUТР Niсk-Еnd Labelling),выявляющим одно- и двунитевые разрывы в ДНК. Данные о фрагментации ДНКсперматозоидов были предоставлены отделением вспомогательных репродуктивныхтехнологий НИИ АГиР им. Д.О.Отта. Была выявлена сильная положительная корреляциясодержания в эякуляте 5hmC-положительных сперматозоидов с частотой TUNELположительных сперматозоидов (r=0,46, P=0,001) (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
