Диссертация (1145832), страница 14
Текст из файла (страница 14)
В сперматогенных клеткахраспределение 5hmC и 5mC были проанализированы в 5000 ядрах и в 15-25 набораххромосом из митотического сперматогония на стадии метафазы, мейотическогосперматоцита на стадии профазы I (в пахитене, диплотене и диакинезе) и стадии метафазыII для каждого из 15 пациентов. Считали, что диплоидное ядро принадлежитсперматогонию Ad, если была обнаружена большая центральная вакуоль (Clermont, 1963).Считали, что все гаплоидные ядра принадлежат постмейотическим сперматогеннымклеткам.После визуального анализа сперматозоидов из эякулятов измеряли интенсивностьфлуоресценции АТ-5hmC и АТ-5mC для 300 5hmC-положительных и 300 5hmCотрицательныхсперматозоидовот3индивидов.Интенсивностьфлуоресценциирассчитывали в условных единицах (у.е.) для каждого сперматозоида с использованиемпрограммного обеспечения Image J 1.48v.2.2.10.
Статистическая обработка результатовСтатистическую обработку данных проводили с помощью программ Statistica 8.0 иGraphPad Prism 6.01.56Для расчета ошибки доли содержания хромосом с асимметричным распределением5hmC использовали следующую формулу: (√p*(1-p)/n)×100%, где р – доля хромосом сасимметричным распределением 5hmC в сестринских хроматидах (в виде десятичнойдроби), n – общее число проанализированных хромосом.РаспределениеданныхоценивалосьпотестуД'Агостино-Пирсона.Непараметрические данные сравнивались с использованием U-критерия Манна-Уитни.Коэффициентыранговойкорреляциибылирассчитанысиспользованиемнепараметрического теста Спирмена.Соотношениегидроксиметилированныхинегидроксиметилированныхдиплоидных и гаплоидных ядер из образцов тестикулярной ткани у пациентов собструктивной и необструктивной азооспермией сравнивали с использованием z-критерияФишера.Число гидроксиметилированных хромосом в метафазных пластинках из клетокэмбриональных и экстраэмбриональных тканей эмбрионов 5-12 недель развитиясравнивали с использованием непараметрических критериев Крускала-Вэллиса длясравнений 4-х выборок и Манна-Уитни для сравнений 2-х выборок, посколькуанализируемые величины были дискретны, а выборки не равны по объёму.Графики и рисунки, создавали и редактировали с использованием GraphPad Prismv.6.01, Adobe Photoshop CS3 Extended v.10.0, ImageJ 1.49u, Microsoft Excel 2003.57ГЛАВА 3.
РЕЗУЛЬТАТЫСцельюисследованииантител,выявленияиспользовалиспецифичногидроксиметилированногометоднепрямойсвязывающихсясцитозинавнастоящемиммунофлуоресценции. Применение5-гидроксиметилцитозином,являетсявысокоэффектиным подходом для оценки специфичности гидроксиметилированиягенома: как хромосом, так и интерфазных ядер. Кроме того, методы непрямойиммунофлуоресценции дают хорошо воспроизводимые результаты и позволяют вестиинформативный анализ даже на единичных клетках: зиготах, бластомерах, гаметах(Santos, Dean, 2006). Учитывая то, что 5hmC является продуктом окисления 5mC, внастоящемисследованиипроводилиодновременнуюдетекциюобеихформмодифицированного цитозина.3.1.Распределение5hmCи5mCвгеномезародышейчеловеканадоимплантационных стадиях развития3.1.1. Гидроксиметилирование и метилирование ДНК метафазных хромосомразнородительского происхождения на стадии зиготыРаспределениеиммунофлуоресцентной5hmCидетекции5mCсбылопомощьюпроанализированоспецифичныхметодомантителкгидроксиметилированному и метилированному цитозину на метафазных хромосомахзигот.
Всего было проанализировано 20 триплоидных зигот. В семи из 20 включённых ванализ триплоидных зигот родительские хромосомы были видны в виде отдельнолежащих гаплоидных наборов хромосом материнского и отцовского происхождения(всего 21 набор хромосом) (рис. 4). В отдельно лежащих наборах хромосом наблюдалиразную интенсивность сигналов АТ-5hmC: в шести зиготах два набора хромосом имелиодинаково интенсивный сигнал, а в третьем сигнал имел меньшую интенсивность (рис. 4);в одной зиготе наблюдали обратную картину – один набор хромосом характеризовалсяболее интенсивным сигналом АТ-5hmC, чем два других.
Определение набора хромосомотцовского происхождения в зиготе возможно по наличию Y хромосомы. Однако, такимобразом можно установить только около половины наборов хромосом отцовскогопроисхождения, т.к. в процессе созревания мужских половых клеток после мейозавероятность попадания в сперматозоид Y хромосомы, так же, как и X хромосомы, равнаприблизительно 50%. Во всех восьми слабогидроксиметилированных наборах былаидентифицирована хромосома Х. В четырех из 13 высокогидроксиметилированныхнаборов была идентифицирована хромосома Х, а в остальных девяти – хромосома Y, чтодоказываетихотцовскоепроисхождение(рис.4).Крометого,вовсех58сильногидроксиметилированных наборах хромосом был выявлен низкий уровень 5mC –характерный признак отцовского генетического материала на стадии зиготы (Iqbal et al.,2011; Wossidlo et al., 2011).
В то же время во всех слабогидроксиметилирванных набораххромосом зигот, уровень метилирования был высоким, что характерно для генетическогоматериала материнского происхождения (Iqbal et al., 2011; Wossidlo et al., 2011) (рис. 4).Рисунок 4. Метафазные хромосомы триплоидной зиготы. А – иммунофлуоресцентноеокрашиваниеспомощьюантителк5hmC(флуорохромAlexa488).Б–иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител к 5mC (флуорохром Cy3). В –совмещенное изображение. Г – QFH/AcD-окрашивание. Обозначены наборы хромосомотцовского (♂) и материнского (♀) происхождения и половые хромосомы.59Для объективизации данных визуального анализа интенсивности метилирования игидроксиметилирования наборов хромосом было проведено измерение интенсивностифлуоресцентного сигнала антител к 5hmC и 5mC в наборах хромосом отцовского иматеринского происхождения на стадии зиготы.
Для измерений интенсивностифлуоресцентного сигнала были использовали только те зиготы, в которых наблюдалиотдельно лежащие наборы родительских хромосом (n=7). При сопоставлении среднейотносительной интенсивности флуоресцентных сигналов АТ-5hmC и АТ-5mC междунаборами хромосом отцовского и материнского происхождения выявлены статистическидостоверные различия: флуоресценция 5mC была выше в наборах хромосом материнскогопроисхождения по сравнению с отцовскими, а флуоресценция 5hmC была выше в набораххромосом отцовского происхождения по сравнению с материнскими (рис. 5) (U-критерийМанна-Уитни для малых выборок, P<0,0001).
Таким образом, локализация 5mC и 5hmCкомплементарна в наборах отцовских и материнских хромосом на стадии зиготы. Крометого, эти полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что,несмотрянапротивоположноеметилированногоивлияниенагидроксиметилированногофункциональныйцитозина,настатусхроматинахромосомахможетприсутствовать как одна, так и другая модификация одновременно.Рисунок 5.
Относительная интенсивность флуоресценции 5mC и 5hmC в метафазныххромосомах разнородительского происхождения в триплоидных зиготах (*,**P<0,0001, Uкритерий Манна-Уитни для малых выборок).В остальных 13 из 20 проанализированных триплоидных зигот хромосомыразнородительского происхождения были смешаны на препарате или были расположеныблизко друг к другу, что сделало невозможным идентификацию родительских наборов60хромосом. Был проанализирован характер гидроксиметилирования и метилирования ДНКв триадах гомологичных хромосом.
Гомологичные хромосомы во всех триадахотличались интенсивностью гидроксиметилирования: два гомолога имели одинаковуюфлуоресценцию АТ-5hmC, в то время как третья имела более высокую флуоресценцию утрёх зигот и более низкую флуоресценцию у десяти зигот. Картина распределения 5mCбыла обратной: высокогидроксиметилированные хромосомы содержали мало 5mC, тогдакак хромосомы с низким уровнем 5hmC были сильно метилированы.Наследующемэтапеработыбылпроведёнанализраспределенияиммунофлуоресцентных сигналов 5hmC и 5mC вдоль плеч метафазных хромосом.Идентификацию хромосом проводили с помощью дифференциального QFH/AcDокрашивания.Былопроанализировано 462 хромосомы из20 зигот.На всехпроанализированных хромосомах была выявлена гетерогенность распределения 5hmC и5mC по длине хромосом.
Для определения сегментной локализации флуоресцентныхсигналов 5hmC и 5mC на хромосомах, были составлены совмещенные кариограммыметафазныххромосомпослеиQFH/AcD-окрашиванияиммунофлуоресцентногоокрашивания с помощью антител к 5hmC и 5mC. В хромосомах из наборов хромосомотцовского происхождения наблюдали преимущественную локализацию 5hmC вотдельных участках хромосом, имеющих четко визуализируемые границы. При анализесовмещенных кариограмм установлено, что хроматин, обогащенный 5hmC, локализуетсяв QFH-негативных сегментах (R-сегментах) (рис.
6). Сегментоспецифичное распределение5hmCбылоподтвержденоспомощьюпостроенияграфиковинтенсивностифлуоресцентного сигнала вдоль плеч хромосом, измеренной в программе ImageJ. Районыс различной интенсивностью флуоресценции определяли по пикам и обратным пикам награфиках. При этом протяженность пиков соответствовала протяженности R-сегментов, аобратных пиков – протяженности G-сегментов, выявляемых на дифференциальноокрашенных хромосомах (рис. 6).В хромосомах из наборов хромосом материнского происхождения из-за слабогообщего уровня гидроксиметилирования чётко идентифицировать границы районов,обогащенных 5hmC, не удалось.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
