Диссертация (1145832), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Число проанализированных образцов.Исследуемый материалЧисло проанализированных образцовЭякулят50Биоптат семенника15Яйцеклетка19Зигота203-клеточный эмбрион44-5-клеточный эмбрион57-клеточный эмбрион – морула15Бластоциста375-12 недельный эмбрион4482.2.
Методы2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер изнеоплодотворившихся яйцеклеток, зигот и бластомеров доимплантационныхзародышей человекаПрепараты метафазных хромосом и интерфазных ядер из яйцеклеток, зигот идробящихся зародышей человека были приготовлены по методике А.П.Дыбана (Dyban etal., 1993) с собственными модификациями (Pendina et al., 2011).Яйцеклетки и доимплантационные зародыши культивировали в чашках Петри впитательной среде объёмом 100 мкл, покрытой слоем минерального масла. За 6-12 часовдо фиксации материала, в среду добавляли 5 мкл 0,1% водного раствора колхицина(Merck, Германия) и инкубировали при 37°C.
Процедуру приготовления препаратаначинали с переноса материала (яйцеклетки, зиготы, бластомеров зародыша) изпитательной среды в гипотонический раствор (0,9% Na3C6H5O7 – цитрат натрия) на 5-10минут. Перед каждым переносом клеток в пипетку набирали несколько микролитровгипотонического раствора и затем захватывали клетки.
После этого клетки с небольшимколичеством гипотонического раствора переносили на заранее отмеченное место напредметном стекле. После этого давали капле на стекле слегка подсохнуть и наносили 2,5мкл свежеприготовленного холодного (-20°C) фиксирующего раствора (метанол и ледянаяуксусная кислота в соотношении 3:1). Затем повторно давали стеклу слегка подсохнуть,наносили 2,5 мкл холодного фиксирующего раствора и полностью высушивали препарат.Все процедуры выполняли с использованием стереомикроскопа для контроля надперемещением клетки.2.2.2.
Приготовление цитогенетических препаратов из фрагментов тестикулярнойткани, ворсин хориона и фрагментов эмбриональных органовОбразцы биоптатов семенников (10-15 мг) помещали в чашку Петри с питательнойсредой Flushing medium (Origio, 10845060, Denmark) сразу после проведения биопсии ихранили при комнатной температуре не более 60 минут. Образцы ворсинчатого хориона иэмбриональных органов отбирали из тканей соскоба полости матки, промытыхфизиологическимраствором,подконтролемстереоскопическогобинокулярногомикроскопа МСП-1 (ЛОМО) при увеличении в 5-10 раз.Препараты хромосом и интерфазных ядер получали «прямым» методом (безпредварительного культивирования) по описанной ранее методике с собственнымимодификациями (Кузнецова и др., 2013).49Образцы тканей делили на небольшие фрагменты и переносили (по 3-5 мг) впластиковые флаконы объемом 20 мл с 5 мл 0,9% цитрата натрия и колхицином вконечной концентрации 2,5 мкг/мл.
Гипотоническую обработку материала проводили прикомнатной температуре в течение 60-90 мин. Затем из флаконов удаляли с помощьюдозатора2,5млгипотоническогораствораидобавлялитакойжеобъемсвежеприготовленного фиксатора (метанол : ледяная уксусная кислота в соотношении3:1). Первую порцию фиксатора добавляли по каплям, встряхивая флакон, затем струйно.Префиксациюпроводилиприкомнатнойтемпературе20-30мин.Затемвесьпрефиксирующий раствор удаляли с помощью дозатора.
Во флаконы с фрагментамитканей добавляли 5 мл холодного (4оС) фиксатора (метанол : ледяная уксусная кислота всоотношении 3:1). Фиксацию проводили 1,5-2 часа при 4оС.Затем во флаконы с зафиксированным материалом добавляли около 5 млдистиллированной воды комнатной температуры. Через 1-2 мин, когда фрагменты тканейопускались на дно флакона, вынимали их пинцетом, обсушивали фильтровальной бумагойи переносили на предметные стекла в каплю (около 0,3 мл) 60% уксусной кислоты.Мацерацию проводили под контролем стереоскопического бинокулярного микроскопаМСП-1 (ЛОМО) при увеличении в 10 раз, наблюдая за выходом клеток в проходящемсвете. Через 30-40 секунд фрагмент ткани убирали из капли и полученную в каплесуспензию покачиванием стекла распределяли по поверхности.
Затем на препаратнаносили 2-3 капли фиксатора (метанол : ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1) ивысушивали при комнатной температуре.Не использованные для приготовления цитогенетических препаратов фрагментытестикулярной ткани хранили в метанол-уксусном фиксаторе при -20°C.2.2.3. Приготовление гистологических препаратов из биоптата тканей семенникаОбразцы тестикулярной ткани, хранившиеся в метанол-уксусном фиксаторе,помещали в 10% формалин на 24 часа. Зафиксированные формалином образцыпромывали проточной водой в течение 30 минут и подвергали обработке в аппарате LogosJ (Milestone, Италия) по протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.Фрагменты ткани толщиной не более 3 мм обработывали в 60% этиловом спирте втечение 3 мин при комнатной температуре, затем – в двух сменах 95% этилового спиртапо 2 мин в каждой при комнатной температуре, затем – в 95% этиловом спирте 25 мин при65°С с применением электрического и микроволнового нагрева, затем – в 95%изопропаноле (ЭргоПродакшн, Россия) в течение 72 мин при 68°С с применениемэлектрического и микроволнового нагрева.
После этого образцы помещали в парафин тип503 (Paraffin Type 3, Thermo Scientific, США) на 75 мин при 82°С с применением толькоэлектрического нагрева. Затем образцы заливали в парафин тип 9 (Paraffin Type 9, ThermoScientific, США) и помещали на криоконсоль (-2°С) для увеличения твердости парафина.С парафиновых блоков с помощью ротационного микротома HM 340E (Thermo Scientific,USA) получали срезы толщиной 2,5 мкм, которые монтировали на положительнозаряженные предметные стекла Superfrost Plus (Thermo Scientific,США). Дляоптимальной адгезии срезов стекла инкубировали в течение ночи при 37°С. Затемгистологические препараты в течение 30 минут подвергали демаскировке (HIER – heatinduced epitope retrieval) с использованием фирменного буфера для демаскировки с pH 6,0(Thermo Scientific, США) при 98°С в устройстве PT-Module (Thermo Scientific, США).После этого ванну с буфером и стеклами охлаждали до 65°С, вынимали препараты ипереносиливраствор1хPBSкомнатнойтемпературыдляпоследующегоиммунофлуоресцентного окрашивания с помощью антител к 5hmC и 5mC.2.2.4.
Приготовление препаратов из образцов эякулятаОбразцы эякулята помещали в пробирки и осаждали центрифугированием втечение 5 минут при 1700 об/мин. Далее сливали супернатант и пипетировали осадок дообразования однородной суспензии. К получившейся суспензии по капле добавляли 5 млгипотонического раствора (0,9% цитрата натрия), после чего снова пипетировали.Гипотоническую обработку материала проводили при комнатной температуре в течение40 минут. После этого центрифугировали в течение 10 минут при 1700 об/мин, сливалисупернатант и пипетировали осадок. К осадку добавляли по капле 5 мл фиксатора (этанол+ ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1), периодически встряхивая пробирку,после чего осуществляли пипетирование до образования однородной суспензии.Фиксацию проводили не менее 2-х часов при температуре 4°С.
Зафиксированнуюсуспензию пипетировали и раскапывали на чистые обезжиренные предметные стекла.Препараты эякулированных сперматозоидов высушивали при комнатной температуре.2.2.5.QFH-окрашиваниецитогенетическихпрепаратовяйцеклеток,зигот,бластомеров доиплантационных зародышей и сперматогенных клеток человекаQFH-окрашивание препаратов хромосом и интерфазных ядер проводили постандартной методике с собственными модификациями (Кузнецова и др., 2013).Препараты обрабатывали в течение 5 минут насыщенным солевым буфернымраствором Дюльбекко (CaCl2×2H2O – 0,133 г/л; MgCl2×6H2O – 0,1 г/л; KCl – 0,2 г/л; NaCl– 8,0 г/л; Na2HPO4 – 1,15 г/л; KH2PO4 – 0,2 г/л; pH 7,2-7,4). Затем окрашивали в растворе51красителя Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, США) (0,5 мкг/мл), приготовленном на буфереДюльбекко (pH 7,2-7,4), в течение 15-25 минут. Далее препараты в течение 5 минутобрабатывали свежей порцией буферного раствора Дюльбекко (pH 7,2-7,4), а затемвысушивали на воздухе.
Для получения более контрастной окраски на препаратынаносили по две капли 0,02% раствора актиномицина D (Sigma-Aldrich, США) объемом 30мкл, накрывали покровными стёклами и инкубировали в течение 20-30 минут прикомнатной температуре в отсутсвии света. Затем покровные стёкла смывали холоднойпроточной водой, и высушивали препараты на воздухе при комнатной температуре. Насухие препараты наносили по две капли заключающего раствора объёмом 30 мкл,состоящего из цитратно-фосфатного буфера Мак-Ильвейна (Na2HPO4 – 30 г/л; C6H8O7 –12,18 г/л; pH 4,2) и глицерина в соотношении 1:1, накрывали покровными стёклами иудаляли излишки заключающего раствора фильтровальной бумагой.Фотоизображения хромосом и интерфазных ядер получали с помощью микроскопаLEICA DM LS, оборудованного объективами FLUOTAR 20х/0,40 и 100х/1,30-0,60,автоматической фотонасадкой, цветной камерой Leica DFC 320, блоком светофильтров.Для получения фотоизображений использовали программное обеспечение Leica DFCTwain. После получения фотоизображений препараты отмывали от заключающегораствора, проводя через воду и серию спиртов 70%, 80%, 96% при комнатнойтемпературе, и высушивали на воздухе для последующего иммунофлуоресцентногоокрашивания с помощью антител к 5hmC и 5mC.2.2.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
