Диссертация (1145832), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Иммунофлуоресцентное окрашивание цитогенетических и гистологическихпрепаратов с помощью антител к 5hmC и 5mCИммунофлуоресцентноеокрашиваниецитогенетическихигистологическихпрепаратов с помощью антител к 5hmC и 5mC проводили по описанной ранее методике(Verma, Babu, 1989) с собственными модификациями (Пендина и др., 2005; Efimova et al.,2015).Обезвоженные в серии спиртов 70%, 80%, 96% и высушенные на воздухепрепараты ополаскивали в двух сменах 1xPBS (KCl – 0,2 г/л; NaCl – 8,0 г/л; Na2HPO4 –1,44 г/л; KH2PO4 – 0,24 г/л; pH 7,2-7,4) по 3 минуты в каждой в водяной бане притемпературе 37оС.
После этого при температуре 37оС препараты инкубировали в 0,01%растворе пепсина. Длительность обработки пепсином изменяли в зависимости отпрепарата: для препаратов зигот и зародышей на стадиях дробления до 8 клеток времяобработки составляло 5 минут для препаратов зародышей на стадиях морулы ибластоцисты – до 10 минут, для препаратов тестикулярной ткани – 25 минут, для52препаратов эмбриональных и экстраэмбриональных тканей – 50 минут, для препаратов изэякулятов этот этап пропускали. Препараты промывали в двух сменах 1xPBS (pH 7,2-7,4)по 3 минуты в каждой при комнатной температуре, затем обрабатывали в 2,5% водномрастворе параформальдегида (рН 8,2) в течение 10 минут при температуре 2-4оС.
Далеепрепараты промывали в двух сменах 1xPBS (pH 7,2-7,4) по 3 минуты в каждой прикомнатной температуре, ополаскивали дистилированной водой и высушивали на воздухе.Препараты проводили через серию спиртов (по 3 минуты в 70% и 80%, 5 минут в 95%) ивысушивали на воздухе. Денатурацию препаратов осуществляли в 2M растворе HCl прикомнатной температуре. Продолжительность денатурации составляла 11 минут дляпрепаратов из яйцеклеток и доимплантационых зародышей, 20-25 мин – для препаратовиз ворсин хориона, эмбрионального лёгкого, тестикулярной ткани и эякулированныхсперматозоидов. Препараты промывали в двух сменах 1xPBS (pH 7,2-7,4) по 3 минуты вкаждой при температуре -20оС.
После этого в течение 3 минут промывали препараты в1xPBS (pH 7,2-7,4) при температуре 4оС, а затем в 1xPBS (pH 7,2-7,4) при комнатнойтемпературе. Для цитогенетических препаратов из биоптатов семенников, на которыхбыла проведена флуоресцентная гибридизация in situ (см. 2.2.7), а также длягистологических препаратов из биоптатов семенников, этап предобработки и денатурациибыл пропущен.На препараты наносили по 100 мкл блокирующего раствора (1% BSA, 0,1%Tween20 в 1хPBS с pH 7,2-7,4), накрывали покровным стеклом и инкубировали в течение40 минут во влажной камере при 37°С.
По завершении инкубации, не высушиваяпрепараты, наносили 100 мкл смеси антител к 5mC (mouse anti-5mC, Eurogentec, Бельгияили Millipore, clone 33D3, MABE146, США) и 5hmC (rabbit polyclonal, Active Motif, 39769,США), разведенных в блокирующем растворе в соотношении 1:500. Препаратыинкубировали в течение 60-90 минут во влажной камере при комнатной температуре.Затем препараты промывали в трех сменах буферного раствора 1xPBS (pH 7,2-7,4),содержащего 0,5% Tween 20 (Sigma-Aldrich, США) по 3 мин в каждой на водяной банешейкере при температуре 37оС. Не высушивая препараты, наносили под покровное стекло100 мкл смеси вторых антител, конъюгированных с флуорохромами Alexa 555 (goat antimouse, Invitrogen, США)/goat anti-mouse Cy3 (GE Healthcare Life Sciences, PA43002,Швеция) и Alexa 488 (goat anti-rabbit, Invitrogen, США), разведенных в блокирующемрастворе BSA в соотношении 1:200-1:250.
После этого препараты инкубировали в течение60-90 минут во влажной камере при температуре 37оС. Далее препараты промывали в трехсменах 1xPBS (pH 7,2-7,4), содержащего 0,5% детергента Tween 20 (Sigma-Aldrich, США)по 3 минуты в каждой на водяной бане-шейкере при температуре 37оС. Затем53ополаскивали препараты в 1хPBS (pH 7,2-7,4) и в дистиллированной воде комнатнойтемпературы и высушивали на воздухе. Препараты проводили через серию спиртов 70%,80%, 95%, инкубируя по по 3-5 мин в каждом, высушивали на воздухе, заключали вфотозащитный раствор Vectaschield H-1200 (Vector Laboratories, США), содержащийкраситель DAPI, и хранили при температуре 4оС до проведения микроскопическогоанализа.2.2.7.
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)FISH проводили на цитогенетических препаратах из биоптатов семенников доиммунофлуоресцентной детекции 5hmC и 5mC с целью определения плоидностиинтерфазных ядер, на основании которой можно судить о прохождении сперматогеннойклеткоймейотическогоделения.Предобработкупрепаратовдлягибридизации,гибридизацию с ДНК-зондами, а также отмывки препаратов после гибридизациипроводили в соответствии с рекомендациями фирмы производителя ДНК-зондов (Abbottmolecular, США) с собственными модификациями (Pendina et al., 2017).Препараты проводили через серию спиртов 70%, 80%, 95% по 3 минуты в каждом,высушивали и инкубировали в 4хSSC (водный раствор 600 mM NaCl и 60 mM цитратанатрия) в течение 5 минут в водяной бане при 37°С. Препараты обрабатывали 0,01%расвором пепсина в течение 25 минут при 37°С, затем промывали в 4хSSC 5 минут вводяной бане при 37°С.
Проводили фиксацию препаратов в 2,5% водном растворепараформальдегида, охлажденном до 4°С, в течение 11 минут. Промывали препараты вдвух сменах 4хSSC по 5 минут в каждой на водяной бане при 37°С и ополаскивалидистиллированной водой. Проводили препараты через серию спиртов 70, 80, 95% по 3минуты в каждом и высушивали на воздухе.Готовили смесь для гибридизации из 1 мкл ДНК-зонда, специфичного кцентромерной последовательности хромосомы 1 Vysis CEP1 (D1Z5) (Abbott Molecular,США), 1 мкл ДНК-зонда, специфичного к центромерной последовательности хромосомы11 Vysis CEP11 (D11Z1) (Abbott Molecular, США), 7 мкл буфера для гибридизации (AbbottMolecular, США) и 1 мкл деионизированной воды.
Суммарный объём смеси составлял 10мкл. Гибридизационную смесь объемом 0,5 мкл наносили на ранее выбранные зоныпрепарата и накрывали покровными стёклами диаметром 8 мм. Края покровных стеколзаклеивали резиновым клеем и помещали препараты в гибридизер Thermobright (Stat SpinInc., США). Денатурацию проводили в течение 10 минут при 78°С. Гибридизациюпроводили в течение 12-18 часов при 37°С. После завершения гибридизации клей удалялипинцетом. Промывали препараты в 4хSSC, содержащим 0,5% Tween 20 (Sigma Aldrich,54USA) в течение 5 минут и в трех сменах 4хSSC при 37°С на водяной бане в течение 5минут в каждой. Препараты ополаскивали в дистиллированной воде, проводили черезсерию спиртов 70%, 80%, 95% по 3 минуты в каждом и высушивали на воздухе. Далеепроводили иммунофлуресцентное окрашивание препаратов антителами к 5hmC и 5mC,пропуская этап предобработок и денатурации (см.
2.2.6).2.2.8. Анализ препаратовАнализ препаратов и получение фотоизображений проводили c использованиемфлуоресцентных микроскопов:•Leica DM2500, оборудованного объективами HCXPL FLUOTAR 20x/0,50 и100х/1,30-0,60, фотонасадкой, черно-белой камерой Leica DFC 345 FX, блокомсветофильтровSOR,SGR,SREиA. Дляполученияфотоизображенийиспользовали программное обеспечение Leica Application Suite V.3.8.0;•Leica DMLS, оборудованного объективами FLUOTAR 20х/0,40 и 100х/1,30-0,60,фотонасадкой, цветной камерой Leica DFC 320, блоком светофильтров. Дляполучения фотоизображений использовали программное обеспечение Leica DFCTwain.•ZEISS Axio Imager.A2, оборудованного объективами EC Plan-Neofluar 10x/0.3,20x/0.5, 63x/1.25 и 100х/1.3, автоматической фотонасадкой, цветной камеройMetasystem Cool Cube 1 и блоком светофильтров.Фотоизображения хромосом, интерфазных ядер и сперматозоидов редактировали спомощью программного обеспечения Adobe Photoshop CS3 Extended v.10.0, применяяинструменты «кадрировать», «повернуть», «яркость/контраст» и «резкость» для всегоизображения.2.2.9.Измерениеинтенсивностифлуоресцентногосигналапослеиммунофлуоресцентной детекции 5hmC и 5mC на препаратахИзмерение интенсивности флуоресцентного сигнала после иммунофлуоресцентнойдетекции 5hmC и 5mC на метафазных хромосомах зигот проводили на цифровыхфотоизображениях с помощью программы Image J 1.49u.
Использовали инструментыпрограммы, позволяющие измерять интенсивность сигнала в выделенной областиизображения. Интенсивность флуоресцентного сигнала измеряли для каждой хромосомыв наборе. Каждому пикселю в выделенной области изображения автоматическиприсваивалось значение от 0 до 255 в зависимости от его яркости. Средняя интенсивностьсвечения выделенной области рассчитывалась автоматически при суммировании55значений, присвоенных всем пикселям, и делении полученной суммы на число пикселей.Средние значения флуоресценции сигналов 5mC были разделены на меньшее из трёхзначений для каждой серии измерений.
Аналогичные действия были проведены длязначений флуоресценции сигналов 5hmC. Полученные средние относительные значенияинтенсивности флуоресценции сравнивали в программе GraphPad Prism 6 с помощью Uкритерия Манна-Уитни для малых выборок.При построении графиков распределения иммунофлуоресцентного сигнала вдольплеч метафазных хромосом зигот для каждой хромосомы выбирали центральную ось спомощью инструмента «segmented line», вдоль которой с помощью инструментапрограммы ImageJ 1.49u проводили линию, шириной в один пиксель.
Каждой точкепрограмма ImageJ присваивала значение яркости сигнала от 0 до 255, соответствующееинтенсивности флуоресценции в данной точке. После этого по полученным значенияминтенсивности флуоресценции антител строили графики распределения сигнала вдольхромосомы с помощью программы Microsoft Excel 2003. Районы с различнойинтенсивностью флуоресценции определяли по пикам и обратным пикам на графиках.Гидроксиметилирование и метилирование ДНК в сперматогенных клетках иэякулированных сперматозоидах были сначала проанализированы качественно на основевизуальной оценки присутствия/отсутствия 5hmC и 5mC.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
