Диссертация (1145832), страница 18
Текст из файла (страница 18)
В отличие отнего, 5hmC содержится в 40,75±5,89% ядер сперматогониев и в 1,18±0,51% ядерсперматид, и отсутсвует в делящихся митозом сперматогониях, делящихся мейозомсперматоцитах, а также в сперматозоидах.3.3. Анализ гидроксиметилирования и метилирования ДНК метафазных хромосом уэмбрионов человека 5-12 недель развитияВ ходе выполнения предыдущих этапов исследования установлено, что характергидроксиметилирования ДНК претерпевает глобальные изменения как в гаметогенезе, таки в доимплантационном эмбриогенезе человека.
При этом на стадии бластоцисты,большинство хромосом практически не содержат 5hmC, и только в единичных из нихнаблюдается гемигидроксиметилирование – асимметричное гидроксиметилированиесестринских хроматид (рис. 7). Возникает закономерный вопрос, о том, как изменяютсяпаттерны гидроксиметилирования хромосом в постимплантационном периоде развития –во время гисто- и органогенеза, когда из тотипотентных бластомеров образуются всеткани и органы эмбриона и его оболочек. Известно, что в запуске генетических программразвития различных тканей и органов большое значение имеют эпигенетическиемодификациигенома,втомчислеметилированиеидеметилированиеДНК,определяющие функциональный статус генома клетки (Feng et al., 2010; Szulwach et al.,2011).Методомнепрямойиммунофлуоресценциибылизученхарактергидроксиметилирования и метилирования ДНК метафазных хромосом из спонтанноделящихся клеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканей человека.
Препараты80метафазных хромосом были получены «прямым» методом (без предварительногокультивирования) из клеток цитотрофобласта хориона и эмбрионального лёгкого 4-хэмбрионов 5-12 недель развития с нормальным кариотипом (1 эмбрион на сроке развития5-6 недель, 2 эмбриона на сроке развития 8-9 недель, 1 эмбрион на сроке развития 11-12недель). Для детекции хромосом использовали окрашивание DAPI. О локализации нахромосомах гидроксиметилированной и метилированной ДНК судили по наличиюиммунофлуоресцентного сигнала на совмещенных изображениях метафазных пластинокпосле окрашивания DAPI и иммунодетекции модифицированного цитозина (рис.
19).Распределение метилированной ДНК на метафазных хромосомах из клетокцитотрофобласта хориона и эмбрионального лёгкого характеризовалось сегментнойспецифичностью:5mCбылпреимущественнолокализованвR-сегментахигетерохроматиновых блоках хромосом 1, 9, 16 и Y. Такой тип распределения 5mC былхарактерен для всех хромосом на всех проанализированных метафазных пластинках, чтосогласуется с данными, полученными в лаборатории ранее (Баранов и др., 2005; Ефимова,2012).При анализе распределения гидроксиметилированной ДНК была выявлена иная,крайне гетерогенная, картина. Так, в пределах каждой метафазной пластинки тольконекоторыехромосомысодержали5hmC,втовремякакостальныебылинегидроксиметилированы. Число хромосом, содержащих 5hmC, варьировало на разныхметафазных пластинках, как из клеткок из эмбрионального лёгкого, так и из клетокцитотрофобласта хориона.
При этом не наблюдали специфичности локализации 5hmC вкаких-либо определённых хромосомах набора (рис. 19).81Рисунок 19. Метафазные хромосомы из некультивированных клеток эмбриональноголёгкого человека и цитотрофобласта хориона после окрашивания с помощью антител к5mC (флуорохром Alexa 555), 5hmC (флуорохром Alexa 488) и окрашивания DAPI.Отдельно указаны хромосомы с разным типом распределения сигнала АТ-5hmC нагомологах.Было проведен подсчёт и сравнение числа гидроксиметилированных хромосом вметафазных пластинках из клеток разных тканей: эмбрионального лёгкого и хориона. Дляанализа были выбраны метафазные пластинки хорошего качества с полным наборомхромосом и минимальным числом хромосомных налеганий.
Подсчёт числа хромосом,содержащих 5hmC, произведён в 185 полных метафазных пластинках: в 104 метафазныхпластинках из клеток эмбрионального лёгкого и в 81 метафазной пластинке изцитотрофобласта хориона от 4-х эмбрионов. Число гидроксиметилированных хромосомна метафазную пластинку варьировало от 4 до 45 (в среднем 38,5±1,00) в клеткахэмбрионального лёгкого, и от 0 до 44 (в среднем 25,6±1,60) в клетках цитотрофобластахориона.
Среднее число гидроксиметилированных хромосом на одну метафазную82пластинку в клетках эмбрионального лёгкого оказалось достоверно выше, чем в клеткаххориона (непараметрический критериq Крускала-Вэллиса, p<0,0001).Между отдельными эмбрионами статистически достоверных отличий по числугидроксиметилированных хромосом в метафазных пластинках из клеток лёгкого выявленоне было (р>0,05). Однако, при сравнении числа гидроксиметилированных хромосом вметафазных пластинках из клеток хориона наблюдали различия между анализируемымиэмбрионами (р<0,01) (рис. 20).Рисунок 20. Число гидроксиметилированных хромосом в метафазных пластинках изклеток эмбрионального лёгкого и хориона 4-х эмбрионов человека 5-12 недель развития.По оси Оу – число гидроксиметилированных хромосом в метафазной пластинке.Таким образом, в отличие от стабильного характера распределения 5mC, характергидроксиметилированияметафазныххромосомспонтанноделящихсяклетокэмбрионального лёгкого и цитотрофобласта хориона отличается ярко выраженнойгетерогенностью.На следующем этапе был проанализирован характер распределения сигнала АТ5hmCнагидроксиметилированныххромосомах.Привлекловниманиеналичиеасимметричного сигнала в некоторых гидроксиметилированных хромосомах: 5hmC был83локализованводнойсестринскойхроматиде,втовремякакдругаябыланегидроксиметилирована.
Наряду с такими гемигидроксиметилированными хромосомами,обнаружены хромосомы с симметричным распределением 5hmC в сестринскиххроматидах. При этом как в случае симметричного, так и в случае асимметричногогидроксиметилирования, 5hmC мог быть локализован как на всей хромосоме/хроматиде,так и только в её части (рис. 19), что может быть результатом сестринских хроматидныхобменов.В каждой из 81 метафазной пластинки из клеток цитотрофобласта хориона и 104метафазных пластинок из клеток эмбрионального лёгкого было подсчитано числометафазныххромосомсасимметричнымраспределением5hmC(гемигидроксиметилированных).
Число гемигидроксиметилированных хромосом на однуметафазную пластинку в эмбриональном лёгком варьировало от 0 до 34 (в среднем12,2±0,59) и было значительно выше, чем в цитотрофобласте хориона (р<0,0001), где оносоставляло 0-25 (в среднем 8,6±0,63) (рис. 21). Между разными эмбрионамистатистическизначимыхразличийпосодержаниюасимметричногидроксиметилированных хромосом в метафазных пластинках из клеток лёгкого ицитотрофобласта хориона выявлено не было.Рисунок 21. Сравнение числа хромосом с асимметричным распределением 5hmC вметафазных пластинках из клеток хориона и эмбрионального лёгкого.Полученныеданныесвидетельствуютотканеспецифичностипроцессагидроксиметилирования. Кроме того, сам характер распределения 5hmC, а именно его84асимметрия на сестринских хроматидах, сходная с выявленной в хромосомах дробящихсядоимплантационных зародышей, может свидетельствовать о зависимости уровнягидроксиметилирования от репликации.При анализе распределения 5hmC установлены разные типы локализации сигнала впарах гомологичных хромосом.
Для изучения данного феномена проведено исследованиелокализации 5hmC в парах гомологичных хромосом 1 и 16. Выбор этих хромосомобусловлен тем, что их легко идентифицировать на метафазных пластинках за счётбольших блоков прицентромерного гетерохроматина. Для анализа выбирали метафазныепластинки с чётко идентифицируемыми парами гомологичных хромосом 1 и 16.Проанализировано 189 пар гомологов хромосомы 1 и 172 пары гомологов хромосомы 16 вклетках эмбрионального лёгкого и 95 пар гомологов хромосомы 1 и 97 пар гомологовхромосомы 16 в клетках хориона.
В парах гомологичных хромосом выявлены различныетипы локализации 5hmC (рис. 22):• оба гомолога не содержат 5hmC;• один из гомологов характеризуется асимметричным распределением 5hmC, другойне содержит 5hmC;• оба гомолога характеризуются асимметричным распределением 5hmC;• оба гомолога характеризуются симметричным распределением 5hmC;• один из гомологов характеризуется асимметричным распределением 5hmC, другой– симметричным;• один из гомологов характеризуется симметричным распределением 5hmC, другойне содержит 5hmC.Характер распределения 5hmC, включая симметричное и асимметричное, полноеили частичное гидроксиметилирование хромосомы/хроматиды, не был специфичен длякакой-либо конкретной хромосомы.85Рисунок 22. Различные типы распределения сигнала АТ-5hmC на гомологах хромосомы 1из клеток лёгкого эмбрионов человека 5-12 недель развития.
Совмещённое изображениеАТ-5hmC (флуорохром Alexa 488) и DAPI.Соотношение числа пар гомологичных хромосом с различнымитипамираспределения 5hmC оказалось сходным для хромосом 1 и 16. Однако, при сравнительноманализе числа пар гомологов хромосом 1 и 16 с различными типами распределения 5hmCмежду клетками эмбрионального лёгкого и цитотрофобласта хориона обнаруженытканеспецифичные особенности.
Метафазные пластинки, где оба гомолога не содержали5hmC, в клетках лёгкого встречались реже, чем в клетках хориона. Асимметричный типраспределения 5hmC на обоих гомологах оказался более характерным для метафазныхпластинок из клеток лёгкого по сравнению с клетками цитотрофобласта хориона (рис. 23).Это подтверждает предположение о том, что характер распределения 5hmC являетсяуникальным для конкретного типа ткани.86Рисунок 23. Соотношение различных типов распределения 5hmC на гомологичныххромосомах из клеток хориона и эмбрионального лёгкого. Указаны средние значения иошибка среднего.В связи с тем, что распределение 5hmC анализировали на хромосомах, окрашенныхDAPI после иммунофлуоресцентной детекции модифицированного цитозина, т.е. послеэтапа денатурации ДНК, проведение детального посегментного анализа локализациигидроксиметилированнойДНКбылоневозможным.Установленатенденциякпреимущественной локализации гидроксиметилированной ДНК в DAPI-негативныхсегментах метафазных хромосом (R-сегментах).
В гетерохроматиновых блоках хромосом1, 9, 16, Y, а также в центромерных участках хромосом 5hmC отсутствовал (рис. 24).87Рисунок 24. Локализация 5hmС на гомологичных хромосомах 1 и 16 из клетокэмбрионального лёгкого человека 11-12 недель развития.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
