Диссертация (1145807), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Так,сравнительный анализ показал, что ЧСА эффективнее связывает капрофен и 2антроцен-карбоксильную кислоту [111]. В работе [16] показано, что декстранголубой связывается только с ЧСА и не взаимодействует с БСА. Авторы другойработы[40]показали,чтоварфаринсбольшейэффективностью111взаимодействует с БСА, чем с ЧСА, а его структурный аналог аценокумарол,содержащий дополнительную NO2 группу, наоборот, эффективнее связываетсяс ЧСА. Полифенолы куркумин и диацетилкуркумин намного эффективнеевзаимодействуют с БСА, чем с ЧСА [143].
Выявлено, что пиридоксальфосфатсвязывается в 10 раз менее эффективно с БСА, чем с ЧСА [77], а метилпаратион при комнатной температуре в полтора раза лучше взаимодействует сЧСА, чем с БСА [172]. Таким образом, анализ литературных данных необнаружил каких-либо закономерностей, по которым a priori можноопределить, будут ли ФОС лучше взаимодействовать с ЧСА или БСА. Мыпредположили, что эти закономерности можно выявить с помощью методовмолекулярного моделирования, которые позволяют определять и сравниватьструктурные характеристики сайтов связывания этих ферментов, отвечающиеза эффективность их взаимодействия с лигандами.
Для решения проблемынеобходимо было изучить in silico взаимодействие ФОС с выявленными ранеепотенциальными сайтами (псевдо)эстеразной активности ЧСА и БСА и оценитьвозможность ферментативной реакции в этих сайтах. Для этого методамимолекулярного моделирования было изучено связывание ЧСА и БСА спараоксоном. Обнаруженные сходства и различия структурных характеристиксайтов связывания ЧСА и БСА помогут, во-первых, провести сравнительныйанализ этих белков с эволюционной точки зрения, а во-вторых, позволят болееобоснованно интерпретировать экспериментальные данные, полученные надоступном и дешевом БСА. Для этого в работе был проведен молекулярныйдокинг параоксона в сайты Tyr411(410) и Tyr150(149).Методом молекулярной динамики были изучены конформационныеизменения полученных комплексов во времени. В расчетах использовались 3модели ЧСА (модель 1-3) и 3 модели БСА (модель 4-6) из базы данныхбелковых структур [37].
Перед процедурой молекулярного докинга всемолекулы воды и лигандов были удалены из структур. В качестве модели-1использовались данные рентгеноструктурного анализа молекулы ЧСА сосвязанной в сайте Tyr150 молекулой варфарина, код структуры 2bxd [84]. В112качестве модели-2 использовались данные рентгеноструктурного анализамолекулы ЧСА со связанной в сайте Tyr411 молекулой ибупрофена, кодструктуры 2bxg [84]. Модель-3 («расслабленная» молекула ЧСА) былаполучена из модели-1 минимизацией энергии методом скорейшего спуска [102]с последующей «утряской» молекулы белка методом молекулярной динамики спомощью программного пакета GROMACS 5.0.4 [33].
В качестве модели-4использовались данные рентгеноструктурного анализа свободной молекулыБСА,кодструктуры4f5s[42].Вкачествемодели-5–данныерентгеноструктурного анализа молекулы БСА со связанной в сайте Tyr149молекулой диэтиленгликоля и связанной в сайте Tyr410 молекулой напроксена,код структуры 4or0 [41]. В качестве модели-6 использовались данныерентгеноструктурного анализа молекулы БСА со связанными в сайтах Tyr149 иTyr410 молекулами 3,5-дииодосалициловой кислоты, код структуры 4jk4 [170].Трехмерная модель параоксона была построена и затем минимизированыметодом скорейшего спуска [102] с помощью программы HyperChem 8.0.8 [96].Молекулярный докинг молекулы параоксона в центры связывания альбуминапроводилис помощью программного пакета Autodock4.2[144].
Былиспользован подход, описанный в работе [121]. В исследуемом центресвязывания белка строили решетку аппроксимации размером 60 узлов в x-, y-, иz-направлении и с шагом 0.0375 нм. Для поиска оптимальный конформацийкомплекса альбумин-лиганд был использован ламарковский генетическийалгоритм [144]. Процедуру поиска повторяли 50 раз для каждой пары белоклиганд. Итогом расчета является набор из 50 конформаций комплекса белоклиганд. Для каждой конформации программа Autodock рассчитывает энергиюметодом молекулярной механики с использованием силового поля AMBER,оценивается свободная энергия связывания комплекса в данной конформации ииз ее значения рассчитывается константа диссоциации полученного комплекса[144]. Итоговые конформации комплексов, среднее квадратичное отклонениекоторыхнепревышало0.03нм,считалисьоднойконформациейиобъединялись в кластеры.
В итоге результатом докинга являлся набор из 3-8113наиболее вероятных конформаций (кластеров). В каждую из этих конформацийсходится 4-21 запусков конформационного поиска. Продуктивность всехнайденных методом молекулярного докинга конформаций альбумин-параоксон(возможность атаки каталитической аминокислоты на параоксон) оценивали порасстоянию между гидроксильным атомом кислорода тирозинов или серина иатомом фосфора молекулы параоксона.
Как было установлено ранее, данноерасстояние не должно превышать 0.4нм, чтобы реакция фосфорилированиямогла произойти [193]. Для дальнейшей оценки Kd отбирали конформации,соответствующие критерию продуктивности. Если такие не были найденыметодом молекулярного докинга, приводили значение Kd комплекса с самымнизким значением энергии. Kd каждой отобранной для анализа конформациирассчитывали как медиану всех значений Kd в кластере. Конформационныеизменения во времени комплекса альбумина с параоксоном были рассчитаныметодом молекулярной динамики с помощью программного пакета GROMACS5.0.4 [34].
Комплекс, полученный методом молекулярного докинга, виртуальнобыл помещен в периодическую кубическую решетку, заполненную молекуламиводы. Длина траектории составила 10 нс, шаг интегрирования был принятравным 0.002 пс. Для описания молекул воды использовали модельныйпотенциал, описанный в работе [34]. Для поддержания в расчетномэксперименте постоянной температуры 300 К и постоянного давления 1 барприменяли термостат и баростат Берендсена с временными константами 0.1 пси 1 пс, соответственно [35, 45]. Дальние электростатические взаимодействиярассчитывали методом Эвальда [54]. Взаимодействия Леннард-Джонса неучитывалисьприконформационныхмежатомномизмененийрасстояниикомплексабольше1нм.Расчетуальбумин-параоксонметодоммолекулярной динамики предшествовала минимизация энергии системыметодом скорейшего спуска [102] и релаксация системы длиной 50 пс.Докинг молекулы параоксона в сайты Tyr150(149) и Tyr411(410)альбумина человека и быка.
Для того чтобы количественно оценить и сравнитьэффективность связывания параоксона с молекулой ЧСА и БСА, был проведен114молекулярный докинг молекулы параоксона в сайты Tyr150(149) и Tyr411(410).Для процедуры докинга использовались 3 модели ЧСА (модель 1-3) и 3 моделиБСА (модель 4-6), описанные выше. По результатам процедуры докинга былиоценены Kd комплексов лиганд-белок и расстояния между атомом фосфорапараоксона и гидроксильным атомом кислорода тирозинов (dist(P-O)). Послеанализа возможных конформаций комплекса параоксона с сайтами Tyr150(149)и Tyr411(410) комплексы с минимальными значениями dist(P-O) былиотобраны для дальнейшего анализа.
Для комплекса параоксона с сайтом Tyr150ЧСА была отобрана модель 2, для комплекса параоксона с сайтом Tyr411 ЧСА– модель 3, а для комплексов параоксона с сайтами Tyr149 и Ty410 БСА –модель 5. Количественные энергетические и геометрические характеристикиэтих комплексов приведены в таблице 3.22.Таблица 3.22.Результат молекулярного докинга параоксона в сайты Tyr150(149) иTyr411(410) ЧСА и БСА сывороточного альбуминаСайт связыванияХарактеристикиЧСАБСАЧСА(БСА)связыванияTyr150(149)Tyr411(410)Kd, мкМ49dist(P-O), нм0.360.37Kd, мкМ8713dist(P-O), нм0.370.35На рисунке 3.26а представлены результаты молекулярного докингамолекулы параоксона в сайты связывания Tyr150 ЧСА и Tyr149 БСА. Несмотряна близкие по значению константы диссоциации, положение параоксона внутрисайта связывания существенно отличается для этих двух белков ориентациейнитрогруппы и, как следствие, ориентацией фосфорильного атома кислородалиганда относительно остатка тирозина.
Анализ ближайшего аминокислотногоокружения выявил, что в случае ЧСА нитрогруппа параоксона образует 2водородные связи с аминогруппами остатка Arg222. В молекуле БСА в этомположении находится остаток лизина, который может образовать лишь одну115водородную связь. В случае с БСА нитрогруппа параоксона образует 2водородные связи с аминогруппами остатка Arg198, а в молекуле ЧСА в этомположении находится остаток лизина. Полученный результат согласуется сработой [51], в которой показано, что разница в эффективности связыванияэргостерола с ЧСА и БСА может быть обусловлена образованием водороднойсвязи между эргостеролом и Arg198.
Образование двух водородных связейсильнее влияет на прочность комплекса лиганда с белком (а, значит, и науменьшение Kd), чем одна водородная связь.Поэтому в энергетическинаиболее выгодных конформациях комплекса параоксона с альбумином,полученных методом докинга, группа NO2 лиганда повернута именно кближайшему остатку аргинина.
Различное положение аргининов в ЧСА и БСАи объясняет различие положения молекулы параоксона в сайтах связыванияTyr150 ЧСА и Tyr149 БСА при схожих значениях Kd.абРисунок 3.27. Результат молекулярного докинга параоксона в сайтыТyr150(149) (а) и Tyr411(410) (б) человеческого (серым) и бычьего (черным)сывороточного альбумина.На рисунке 3.26б представлены результаты молекулярного докингамолекулы параоксона в сайты связывания Tyr411 ЧСА и Tyr410 БСА. Несмотряна существенное различие в оценочных значениях Kd, положение молекулыпараоксона относительно аминокислот сайта связывания одинаково для ЧСА иБСА.Сравнениеэнергетическихсоставляющихпоказало,чтовкладэлектростатических взаимодействий между белком и лигандом одинаков дляобоих ферментов, разница осуществляется за счет энергий водородных связей и116ван-дер-ваальсовых взаимодействий.
Такое различие в этих характеристикахможно объяснить разницей в ориентации боковых радикалов аминокислотсайта, преимущественно положения бокового Lys414(413): в случае БСАмолекула параоксона находится в более близком контакте с остатком лизина иобразуется дополнительная водородная связь между фосфорильным атомомкислорода параоксона и аминогруппой лизина. Конформационные изменениябоковыхрадикаловвовремениможнопроанализироватьметодоммолекулярной динамики.Молекулярная динамика комплексов альбумин-параоксон.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
