Диссертация (1145807)
Текст из файла
Федеральное государственное унитарное предприятие"Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологиичеловека" Федерального медико-биологического агентства(ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России)На правах рукописиШМУРАКВладимир ИгоревичСРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ И ЭСТЕРАЗНОЙАКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНАЧЕЛОВЕКА, БЫКА И КРЫСЫ03.01.04 - биохимияДиссертацияна соискание ученой степени кандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биол. наукН.В. ГончаровСанкт-Петербург, 2018 г.2СОДЕРЖАНИЕПеречень условных обозначенийВведениеГлава 1. Обзор литературы1.1.
Общая характеристика альбумина1.2. Эстеразная и псевдоэстеразная активность альбумина1.3. Фосфорорганические соединения (ФОС) и механизм ихтоксического действия1.4. Взаимодействие альбумина с ФОС1.5. Токсикокинетика и токсикодинамика зомана1.6. Сравнительный анализ эстеразной активности альбумина1.7. Субстратная специфичность альбумина1.8. Методы молекулярного моделированияГлава 2. Материалы и методыГлава 3. Результаты и обсуждение3.1 Предварительная оценка связывающей и эстеразной активностиальбумина.3.2. Сравнительное исследование связывающей и эстеразной активностиальбумина человека, быка и крысы с п-нитрофенилацетатом в качествесубстрата.3.3. Сравнительное исследование связывающей и эстеразной активностиальбуминов человека, быка и крысы с параоксоном в качестве субстрата.3.4.
Исследование связывающей и эстеразной активности альбумина сзоманом в качестве субстрата.3.5. Поиск сайтов, ответственных за эстеразную активность альбумина,методами молекулярного моделирования.3.6. Сравнительный анализ in silico связывания параоксона ссывороточным альбумином человека и быка.Глава 4. ЗаключениеВыводыСписок литературыстр.34111114151719243741465353587483881101211321343ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙАХ – ацетилхолинАХЭ –ацетилхолинэстеразаАТХ – ацетилтиохолинБСА – бычий сывороточный альбуминБТХ – бутирилтиохолинБХЭ – бутирилхолинэстеразаДМСО - диметилсульфоксидДТНБ – 5,5-дитио-бис-2-нитробензойная кислотаизо-ОМПА– тетраизопропил пирофосфорамидКЭ – карбоксилэстеразаНТЭ – нейротоксичная эстеразаНФА - п-нитрофенилацетатНФФ - бис-4-нитрофенилфосфатПМФК – пинаколинметилфосфоновая кислотаФБ – фосфатный буферФВ – фенилвалератФОВ – фосфорорганические отравляющие веществаФОС – фосфорорганические соединенияЧСА - сывороточный альбумин человека4ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы.В токсикологических и фармакологических исследованиях очень важнопонимать специфику видовых различий для адекватной интерпретацииполученных результатов при проведении доклинических и клиническихиспытаний, правильного расчета дозировок для человека.
Применительно кизучению фосфорорганических соединений (ФОС), одним из принципиальныхособенностей крови экспериментальных животных - крыс и мышей - являетсяналичие в ней карбоксилэстераз, тогда как в крови человека функциикарбоксилэстераз выполняет альбумин.Альбумин - это главный белок крови млекопитающих, где егоконцентрация составляет 500-700 мкМ. Молекула альбумина не покрытауглеводной оболочкой и может связывать самые разные молекулы и атомы:воду и катионы металлов (Са2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Cd2+, Co2+, Pt2+, Au+), свободныежирныекислотыижирорастворимыегормоны,неконъюгированныйбилирубин, соли желчных кислот, трансферрин, окись азота, аспирин и другиесоединения [71].
Связывая лекарства и токсические вещества, альбумин взначительнойстепениопределяетихтранспортируяктканям-мишенямилифармакоместамиихтоксикокинетику,биотрансформации.Связывание происходит по двум первичным сайтам и нескольким вторичным,количество которых зависит от физико-химических свойств веществ исостояния молекулы альбумина. Так, для жирных кислот – основного лигандаальбумина – имеется 7 сайтов связывания, причем связавшиеся жирныекислоты изменяют полярность и объем сайтов связывания лекарственныхпрепаратов [84].
Наряду с липопротеинами, альбумин является одним изважнейших биомаркеров, определяющих повышенную вероятность летальногоисхода пациентов вне зависимости от пола, возраста и характера ихзаболевания [209, 210].Первые публикации, посвященные альбумину, появились в конце 19 в., атрехмерная структура альбумина сыворотки крови человека (ЧСA) была5исследована лишь в конце 20 в. Аналогичная структура бычьего сывороточногоальбумина (БСA) получена в 2012 г., а трехмерная структура крысиногоальбумина (КСA) не получена до сих пор.
Молекула сывороточного альбуминаобразована одной полипептидной цепью, состоящей из 585, 584 и 583аминокислотныхостатковдляальбуминачеловека,крысыибыка,соответственно [53, 129, 180]. Структура альбумина консервативна для всехмлекопитающих: молекула состоит из трех гомологичных доменов, каждый изкоторых состоит из десяти спиралей и может быть разделен на два субдомена,A и В, содержащих шесть и четыре спиралей, соответственно; эти двасубдомена соединены длинной петлей [42].
Молекула альбумина человека ибыка имеет 17 дисульфидных связей и один остаток цистеина со свободной SHгруппой [42, 84]. В первичной последовательности крысиного альбуминастолько же остатков цистеина, сколько в последовательности человека и быка,и они расположены в тех же позициях [179], поэтому есть все основанияпредполагать, что RSA также имеет 17 дисульфидных связей и один одиночныйцистеинвсвоейтрехмернойструктуре.Выравниваниепервичныхпоследовательностей аминокислотных остатков молекул ЧСA, КСA и БСA спомощью Clustal Omega [171] показало, что наибольшей идентичностьюобладают молекулы ЧСA и БСA – 75,6%. Однако процент идентичностипервичной структуры у молекул ЧСA и КСA составляет 73,0%, а у БСA и КСA— 69,9%.
Если же сравнить непосредственно аминокислотные остатки сайтаСадлоу I (сайт Садлоу II у всех трёх видов альбумина консервативен), то здесьуже молекулы ЧСA и КСA обладают наибольшей идентичностью – 75%, в товремя как БСA демонстрирует лишь 57% идентичность как с КСA, так и с ЧСA.Кроме того, у БСA преобладают замены лизиновых остатков на аргининовые всайте Садлоу I (Lys195→Arg195, Lys199→Arg199), что, вероятно, сказываетсяна его конфигурации, поскольку боковые цепи аргинина сильнее разветвлены.Трехмернаяструктураальбуминадостаточнолабильна,такчтопривзаимодействии с молекулой альбумина разных веществ имеют место такиеэффекты как кооперативность и аллостерическая модуляция, обычно присущие6мультимерным белкам [18]. Однако, в силу вышеуказанных различийпервичныхструктур,порезультатамисследованияфункциональныххарактеристик альбумина одного вида животных нельзя a priori утверждать,что альбумин другого вида будет обладать такими же характеристиками.Например, ЧСA при взаимодействии с жирными кислотами в растворе обладаетвысокой пластичностью и гибкостью, тогда как характеристики БСA в растворепо отношению к жирным кислотам не сильно отличаются от расчетных данных,полученных для его кристаллической структуры [161].В разные годы была показана эстеразная или псевдоэстеразнаяактивностьальбуминапоотношениюкα-нафтилацетатуиn-нитрофенилацетату (НФА), эфирам жирных кислот, аспирину, глюкуронидукетопрофена,циклофосфамиду,октаноилгрелину,эфирамнитроацетанилиду,никотиновойкислоты,нитротрифторацетанилиду,фосфорорганическим соединениям.
В токсикологии наибольший интереспредставляетпроблема(псевдо)эстеразнойактивностиальбуминапоотношению к ФОС (эфирам фосфорной кислоты) и особенно по отношению квысокотоксичным фосфорорганическим отравляющим веществам (ФОВ) –эфирам фосфоновой кислоты, к которым относятся зарин, зоман, V-газы.Установлено два сайта образования ковалентных аддуктов ФОВ с ЧСА - Tyr411и Tyr150 [103, 121]. Однако, несмотря на колоссальные возможностисовременных аналитических методов, имеющиеся данные не позволяютоднозначно решить проблему наличия или отсутствия у альбумина эстеразнойи других типов ферментативной активности.
До сих пор механизмывзаимодействия различных эфиров и других соединений с альбуминомостаются нераскрытыми, а межвидовые исследования вообще не проводились.В настоящее время доступна лишь одна работа, в которой применялись методымолекулярного моделирования для изучения процесса взаимодействия ФОВ(зомана) с альбумином [121]. При этом докинг проводили только в сайтесвязывания Tyr411. Метод молекулярной динамики [137, 211] в этой работе неприменялся.7Цель настоящей работы - биохимическими методами in vitro и методамимолекулярногомоделированияinsilicoисследоватьсвязывающуюиэстеразную активность сывороточного альбумина человека (Homo sapiens),быка (Bos taurus taurus) и крысы (Rattus norvegicus).Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:1) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с п-нитрофенилацетатом;2) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с параоксоном;3) определить характеристики взаимодействия БСA с зоманом методами in vitroи in silico, установить сайты эстеразной активности альбумина;4)исследоватьспомощьюметодовмолекулярногомоделированиявзаимодействие параоксона с возможными сайтами связывания ЧСA и БСA.Положения диссертации, выносимые на защиту1) Предложена схема и математическая модель для описания каталитического истехиометрического взаимодействия альбумина с субстратами эстераз.2) Функциональные характеристики ЧСА и КСА отличаются между собой вменьшей степени по сравнению с функциональными характеристиками БСА.Более консервативными являются БСА по отношению к КСА и ЧСА, а такжесайт Садлоу II по отношению к сайту Садлоу I всех исследованных видовальбумина.3) Эффективность фосфорилирования сайта Садлоу II всех трех видовальбуминапривзаимодействииспараоксономвышеэффективностиацетилирования этого сайта при взаимодействии с п-нитрофенилацетатом.4) Исследование взаимодействия альбумина с зоманом методом остаточногоингибирования ацетилхолинэстеразы позволяет оценить аффинность к двумсайтам альбумина.5) Применение биохимических методов анализа в сочетании с методамимолекулярного моделирования позволяет определить сайты и характервзаимодействия эфирных субстратов с альбумином.8Научная новизна.Впервые в рамках одного исследования проведен сравнительный анализтрех видов альбумина (БСА, ЧСА, КСА) с использованием биохимическихметодов в сочетании с методами молекулярного моделирования (молекулярныйдокинг и молекулярная динамика).
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
