Автореферат (1145805)
Текст из файла
На правах рукописиШМУРАКВладимир ИгоревичСРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ И ЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИСЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА, БЫКА И КРЫСЫ03.01.04 - биохимияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург, 2018 г.Работа выполнена в лаборатории молекулярной токсикологии и экспериментальной терапииФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека»Федерального медико-биологического агентстваНаучный руководитель:Гончаров Николай Васильевичдоктор биологических наук,ведущий научный сотрудник НИИ гигиены, профпатологии иэкологии человека ФМБА России;зав. лабораторией Института эволюционной физиологии ибиохимии им. И.М.
Сеченова Российской академии наук.Официальные оппоненты:Орехов Александр Николаевичдоктор биологических наук, профессор,зав. лабораторией НИИ общей патологии и патофизиологии;директор НИИ атеросклероза (Сколково).Стефанов Василий Евгеньевичкандидат биологических наук, доцент,зав. кафедрой биохимии биологического факультетаСанкт-Петербургского государственного университета.Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное научноеучреждение «Институт экспериментальной медицины»Защита состоится21 июня 2018 г. в ______ на заседании Диссертационного советаД212.232.10 на базе ФГБОУ ВО СПбГУ по адресу:199034,Санкт-Петербург,Университетская наб., 7/9, ауд.
90. Тел.: (812) 328-97-41, e-mail: DSphysiol@bio.spbu.ruС диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького ФГБОУ ВОСПбГУ по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9 и на сайте СПбГУ:https://disser.spbu.ru/Автореферат разослан _____ апреля 2018 г.Ученый секретарь Диссертационного советадоктор биологических наук, профессорН.П.
АлексеевВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы. В токсикологических и фармакологическихисследованиях важно понимать специфику видовых различий экспериментальныхживотных для адекватной интерпретации полученных результатов при проведениидоклиническихиклиническихиспытаний.Применительнокизучениюфосфорорганических соединений (ФОС), одним из принципиальных особенностей кровигрызунов является наличие в ней карбоксилэстераз, тогда как в крови человека функциикарбоксилэстераз выполняет альбумин (Li et al., 2005).Альбумин - это главный белок крови млекопитающих, где его концентрациясоставляет 500-700 мкМ. Наряду с липопротеинами, альбумин является одним изважнейших биомаркеров, определяющих повышенную вероятность летального исходапациентов вне зависимости от пола, возраста и характера их заболевания (Fischer et al.,2014; Orekhov et al., 2014). Молекула альбумина не покрыта углеводной оболочкой иможет связывать самые разные молекулы и атомы: воду и катионы металлов (Са 2+, Zn2+,Cu2+, Ni2+, Cd2+, Co2+, Pt2+, Au+), свободные жирные кислоты (СЖК) и жирорастворимыегормоны, неконъюгированный билирубин, соли желчных кислот, трансферрин, окисьазота, аспирин и другие соединения (Fasano et al., 2005; Sand et al., 2015).
Связываялекарства и токсические вещества, альбумин в значительной степени определяет ихфармако- и токсикокинетику. Связывание происходит по двум первичным сайтам инескольким вторичным. Так, для СЖК имеется 7 сайтов связывания, причем связавшиесяжирные кислоты изменяют полярность и объем сайтов связывания лекарственныхпрепаратов (Ghuman et al., 2005).
Трехмерная структура альбумина сыворотки кровичеловека (ЧСA) была исследована лишь в конце ХХ в., аналогичная структура бычьегосывороточного альбумина (БСA) получена в 2012 г., а структура крысиного альбумина(КСA) не получена до сих пор. Молекула альбумина образована одной полипептиднойцепью, состоящей из 585, 584 и 583 аминокислотных остатков (а.о.) для ЧСА, КСА, БСА,соответственно (Majorek et al., 2012; Consortium, 2015; Strauss et al., 1977). Структураальбумина консервативна для всех млекопитающих: молекула состоит из трехгомологичных доменов, каждый из которых состоит из десяти спиралей и может бытьразделен на два субдомена, A и В, содержащих шесть и четыре спирали, соответственно;эти два субдомена соединены длинной петлей (Bujacz, 2012).
Молекула альбуминачеловека и быка имеет 17 дисульфидных связей и один остаток Cys со свободной SHгруппой (Bujacz, 2012; Ghuman et al., 2005). В первичной последовательности КСАстолько же остатков Cys, сколько в последовательности ЧСА и БСА, и они расположены втех же позициях (Strausberg et al. 2006), поэтому есть основания предполагать, что КСАтакже имеет 17 дисульфидных связей и одиночный Cys в своей трехмерной структуре.Выравнивание первичных последовательностей а.о. молекул ЧСA, КСA и БСA с помощьюClustal Omega (Sievers et al., 2011) показало, что наибольшей идентичностью обладаютмолекулы ЧСA и БСA – 75,6%.
Идентичность первичной структуры ЧСA и КСAсоставляет 73,0%, а БСA и КСA — 69,9%. Если же сравнить непосредственно а.о. сайтаСадлоу I (сайт Садлоу II у всех трёх видов альбумина консервативен), то здесь молекулыЧСA и КСA обладают наибольшей идентичностью – 75%, в то время как БСAдемонстрирует лишь 57% идентичности как с КСA, так и с ЧСA. Кроме того, у БСAпреобладают замены лизиновых остатков на аргининовые в сайте Садлоу I3(Lys195→Arg195, Lys199→Arg199), что сказывается на его конфигурации, посколькубоковые цепи аргинина сильнее разветвлены. Трехмерная структура альбуминадостаточно лабильна, так что при взаимодействии с молекулой альбумина разных веществимеют место такие эффекты как кооперативность и аллостерическая модуляция, обычноприсущие мультимерным белкам (Ascenzi, Fasano, 2010).
Однако, в силу вышеуказанныхразличий первичных структур, по результатам исследования функциональныххарактеристик альбумина одного вида животных нельзя a priori утверждать, что альбуминдругого вида будет обладать такими же характеристиками. Например, ЧСA привзаимодействии с жирными кислотами в растворе обладает высокой пластичностью игибкостью, тогда как характеристики БСA в растворе по отношению к жирным кислотамне сильно отличаются от расчетных данных, полученных для его кристаллическойструктуры (Reichenwallner, Hinderberger, 2013).В разные годы была показана эстеразная или псевдоэстеразная активностьальбумина по отношению к α-нафтилацетату и n-нитрофенилацетату (НФА), эфирамжирных кислот, аспирину, глюкурониду кетопрофена, циклофосфамиду, эфирамникотиновой кислоты, октаноилгрелину, о-нитроацетанилиду и т.д.
В токсикологиинаибольший интерес представляет проблема (псевдо)эстеразной активности альбумина поотношению к ФОС (эфирам фосфорной кислоты) и особенно по отношению квысокотоксичным фосфорорганическим отравляющим веществам (ФОВ) – эфирамфосфоновой кислоты, к которым относятся зарин, зоман, V-газы. Установлено два сайтаобразования ковалентных аддуктов ФОВ с ЧСА - Tyr411 и Tyr150 (Li et al., 2008; John etal., 2010). Однако, несмотря на огромные возможности современных аналитическихметодов, имеющиеся данные не позволяют однозначно решить проблему наличия илиотсутствия у альбумина эстеразной и других типов ферментативной активности.
До сихпор механизмы взаимодействия различных эфиров и других соединений с альбуминомостаются нераскрытыми, а межвидовые исследования вообще не проводились. Имеетсялишь одна работа, в которой применялись методы молекулярного моделирования дляизучения процесса взаимодействия ФОВ (зомана) с альбумином (Li et al., 2008). При этомдокинг проводили только в сайте связывания Tyr411.
Метод молекулярной динамики(McCammon et al., 1977; Стефанов и др., 2012) в этой работе не применялся.Цель настоящей работы - биохимическими методами in vitro и методамимолекулярного моделирования in silico исследовать связывающую и эстеразнуюактивность сывороточного альбумина человека (Homo sapiens), быка (Bos taurus taurus) икрысы (Rattus norvegicus).Для достижения данной цели поставлены и решены следующие задачи:1) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с п-нитрофенилацетатом;2) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с параоксоном;3) определить характеристики взаимодействия БСA и ЧСА с зоманом методами in vitro иin silico, установить сайты эстеразной активности альбумина;4) исследовать с помощью методов молекулярного моделирования взаимодействиепараоксона с возможными сайтами связывания ЧСA и БСA.4Положения диссертации, выносимые на защиту1) Предложена схема и математическая модель для описания каталитического истехиометрического взаимодействия альбумина с субстратами эстераз.2) Функциональные характеристики ЧСА и КСА отличаются между собой в меньшейстепени по сравнению с функциональными характеристиками БСА.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
