Диссертация (1145807), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Материалы и методыВ работе использовались реактивы: альбумины, свободные от жирныхкислот(ЧСА,БСА,нитрофениловый эфирКСА),п-нитрофенилацетатфосфорной кислоты(НФА),(параоксон),диэтил-4-ДТНБ, TRIS,ацетилтиохолин (АТХ) - фирмы Sigma; фосфатный буфер (ФБ) – фирмыБиолот.В экспериментах ex vivo использовали венозную кровь здоровых людей икровь крыс-самок, полученную после декапитации животных. Для получениясыворотки кровь выдерживали при комнатной температуре в течение часа, азатем центрифугировали 20 мин при 3000g.
Содержание альбумина в сывороткечеловека и крысы определяли методом с бромкрезоловым зеленым наавтоматическом биохимическом анализаторе Biocode Hycel Lisa 300 Plus.Определение эстеразной активности по отношению к АТХ производили спомощью планшетного варианта метода Эллмана [69]. Этот метод основан нарасщеплениисубстратасобразованиемтиохолина,которыйпривзаимодействии с 5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБ, реагентЭллмана) образует окрашенный продукт.В лунку 96-луночного планшета вносили 180 мкл ФБ и 10 мклисследуемой пробы. Каждую пробу измеряли в тройном повторе противхолостой пробы. Далее в каждую лунку добавляли по 80 мкл раствора,содержащего ДТНБ (0,8 мг/мл) и АТХ (20 мг/мл) в соотношении 9:1. Планшетинкубировали в течение 10 минут при температуре 37°С, после чего проводилиизмерения величины абсорбции при длине волны 405 нм (Thermo ScientificMultiskan FC microplate photometer).
Расчет активности производили поформуле:Активность АХЭ , мкМ мин 1 л 1 VE, l v t(1)где V - объем реакционной смеси, л , v - объем образца, л, (ΔE/Δt) - изменениеэкстинкции за 1 минуту, l - толщина поглощающего слоя, см, ε - коэффициентмикромолярной экстинкции 2-нитро-5-меркаптобензоата (0,0137 л·мкМ-1∙см-1).47Активность относительно НФА определяли спектрофотометрически (405нм) по накоплению нитрофенола образующегося в результате гидролиза НФА.В лунку 96-луночного планшета вносили 165 мкл ФБ и 10 мкл исследуемойпробы. Каждую пробу измеряли в тройном повторе против холостой пробы.Далее в каждую лунку добавляли по 5 мкл раствора субстрата НФА в этаноле(50мМ).
Планшет инкубировали в течение 10 минут при температуре 37°С,после чего проводили измерения величины абсорбции при длине волны 405 нм.Расчет активности производили по формуле (1), где ε - коэффициентмикромолярной экстинкции нитрофенола (0,01845 л·мкМ-1∙см-1).Активность относительно ФВ определяли по методу Джонсона (492 нм)[104]. В лунку 96-луночного планшета вносили 75 мкл раствора субстрата(фенилвалерата) и 15 мкл исследуемой пробы. Планшет инкубировали втечение 10 минут при температуре 37°С, затем в каждую лунку добавляли по 75мкл раствора SDS 10% и 4-аминоантипирина и 37,5мкл красной кровяной солии проводили измерение при длине волны 492 нм.
Каждую пробу измеряли втройном повторе против холостой пробы. Расчет активности производили поформуле (1), где ε - коэффициент микромолярной экстинкции фенола (0,0139л·мкМ-1∙см-1).Математическаяобработкаданных.Данныепредварительнообрабатывали в Microsoft Excel. Нелинейную и линейную аппроксимациюфункций (методом наименьших квадратов), статистическую обработку данныхи визуализацию результатов выполняли с помощью языка программированияPython (http://www.python.org) в среде Jupyter с установленным ядром IPython.Использовали следующие сторонние пакеты из научного стека: NumPy, Scipy,Matplotlib, Seaborn, Pandas и LmFit [94, 139, 153, 155, 188]. В тексте и таблицахприводятся данные в виде(стандартная ошибка).
Планки погрешностейна рисунках соответствуют значениям стандартной ошибки.Определение эстеразной активности альбумина. Эстеразную активностьальбумина по отношению к АТХ и БТХ определяли планшетным вариантомметода Эллмана на спектрофотометрическом планшетном ридере Thermo48Multiscan Ascent на длине волны 405 нм. Активность относительно ФВопределяли по методу Джонсона (492 нм) [104]. Активность относительно НФАопределялитакжеспектрофотометрически(405нм)понакоплениюнитрофенола образующегося в результате гидролиза НФА. В качествеисследуемого образца использовали раствор бычьего сывороточного альбумина(Sigma) с концентрацией 50 мг/мл в фосфатном буфере (нормальный уровеньсывороточного альбумина у взрослого человека составляет от 35 до 50 мг/мл) исыворотку крови контрольных крыс.Определение связывающей способности альбумина по отношению кзоману.
Для определения константы, характеризующей связывание зомана иБСА, проводили эксперимент по определению скорости гидролиза зомана БСАв зависимости от концентрации зомана в реакционной смеси. Маточныйраствор зомана в концентрации 10 мг/мл готовили в ацетонитриле (HPLCgrade) и хранили не более 1 недели при +4°С. Рабочие растворы зоманаготовилиметодомпоследовательныхразведенийвфосфатно-солевомбуферном растворе (ФСБ). Рабочие растворы зомана и раствор альбумина вконцентрации 20 мг/мл (0,68 мМ) готовили в ФСБ в день эксперимента.Концентрации рабочих растворов зомана составляли: 2×10-4, 6×10-4, 8×10-4,1×10-3, 2·10-3, 4·10-3, 6·10-3 мг/мл.
Для приготовления исследуемых образцовсмешивали 300 мкл рабочих растворов зомана с 300 мкл раствора альбумина.Конечные концентрации зомана и альбумина в исследуемых пробах снизилисьв два раза по сравнению с рабочими концентрациями: 10 мг/мл (150 мкМ)альбумина и 1·10-4, 3·10-4, 4·10-4, 5·10-4, 1·10-3, 2·10-3, 3·10-3 мг/мл зомана.
Дляучета спонтанного гидролиза зомана для каждой концентрации зоманаготовили контрольную пробу, где раствор альбумина заменяли эквивалентнымобъемом ФСБ.Приготовленную пробу перемешивали и помещали в термостат на 37°С.Через 60 минут каждую исследуемую и контрольную пробу разводили в ФСБ иопределяли концентрацию зомана по остаточной активности АХЭ по методу49Эллмана. В опытной пробе определяли концентрацию «свободного» зомана, вконтрольной пробе определяли концентрацию «общего» зомана. Скоростьгидролизазоманаальбуминомрассчитываликакразницумеждуконцентрациями «общего» и «свободного» зомана деленную на 60 минут.Полученные данные вносили в программу GraphPad Prism, трансформировали вдвойные обратные координаты, используя модель обработки данных поЛайнуиверу-Берку, и строили аппроксимирующую линию с расчетом угланаклона и координатами пересечения с осями X и Y.
Угол наклона прямойравен Km/Vmax. Отрезок, отсекаемый на оси Y равен 1/Vmax, отрезок, отсекаемыйна оси X равен -1/Km.Молекулярный докинг. Трехмерные молекулы лигандов были построены изатем минимизированы методом скорейшего спуска [76] с помощьюпрограммы HyperChem 8.0 [96]. В качестве трехмерной модели белка былииспользованы данные рентгеноструктурного анализа молекулы альбуминачеловека из базы данных белковых структур [37], код структуры 2bxd [84].Молекулы воды и лигандов были удалены из структуры. Затем молекулаальбумина была минимизирована методом скорейшего спуска [76] с помощьюпрограммного пакета Gromacs [33].
Заряды на атомах депротонированноготирозина были рассчитаны с помощью программы HyperChem 8.0 [96] методомAb Initio с использовнием базиса STO-3G, как это было описано в работе [81].Рассчитанные параметры были добавлены в библиотеки программ Autodock[144] и Gromacs [33], которые далее были использованы для процедурмолекулярного докинга и молекулярной динамики.Молекулярный докинг лигандов в центры связывания альбуминапроводилис помощью программного пакета Autodock4.0[144]. Былиспользован подход, описанный в работе [121].
В исследуемом центресвязывания белка строили решетку аппроксимации размером 60 узлов в x-, y-, иz-направлении и с шагом 0.0375 нм. Для поиска оптимальных конформацийкомплекса альбумин-лиганд был использован ламарковский генетический50алгоритм [144]. Процедуру поиска повторяли 50 раз для каждой пары белоклиганд. Итоговые конформации комплексов, RMSD которых не превышал 0.1нм, объединяли в кластеры и сортировали по возрастанию константыдиссоциации комплекса. В итоге результатом докинга являлся набор из 3-6наиболее вероятных конформаций. В каждую из этих конформаций сходится 618 запусков конформационного поиска.Для описания сайтов, которые потенциально могли бы отвечать запсевдоэстеразную или эстеразную активность альбумина, использоваликластер,соответствующийсамойэнергетическивыгоднойнайденнойконформации комплекса сайт-лиганд. Константу диссоциации рассчитываликак среднее арифметическое всех значений констант, полученных в данномкластере.ПогрешностьоценивалиметодомКорнфельда,максимальноеотклонение в кластере составило 7% от среднего значения.
Конформации сминимальным Kdиспользовали как стартовые структуры для дальнейшейсимуляции методом молекулярной динамики.Продуктивность всех отобранных конформаций (возможность атакикаталитической аминокислоты на ФОС) оценивали по расстоянию междугидроксильным атомом кислорода (для тирозинов и серинов) или N -атомом(для лизинов) и атомом фосфора молекулы лиганда. Другие найденныеконформации, свободная энергия связывания которых выше (а значит иконстанты диссоциации больше), проверяли на «продуктивность».Конформационныеизменениялиганд-ферментныхкомплексоввовремени были рассчитаны методом молекулярной динамики с помощьюпрограммного пакета GROMACS [76].
Комплексы, полученные методоммолекулярного докинга, виртуально помещали в периодическую кубическуюрешетку, заполненную молекулами воды. Длина всех траекторий составляла1000 пс, шаг интегрирования был принят равным 0.002 пс. Для описаниямолекул воды использовали модельный потенциал, как в работе [34]. Дляподдержания постоянной температуры 300 К и постоянного давления 1 барприменяли термостат и баростат Берендсена с временными константами 0.1 пс51и 1 пс, соответственно [35, 45]. Дальние электростатические взаимодействиярассчитывали методом Эвальда [54].
Взаимодействия Леннард-Джонса неучитывались при межатомном расстоянии больше 1 нм. Длины связейподдерживались постоянными с помощью алгоритма LINCS [90]. Расчетуконформационныхизмененийметодоммолекулярнойдинамикипредшествовала минимизация энергии системы методом скорейшего спуска[167] и релаксация системы длиной 10 пс.Продуктивность комплексов альбумина с ФОС оценивалась по двумизвестным из литературы критериям:1)Геометрия. Ранее квантово-химическими методами на примеревзаимодействия АХЭ с зарином было показано, что реакция гидролизафторсодержащих ФОС возможна только при определенном положении атомафосфора лиганда относительно каталитического серина, а именно атомгидроксильного кислорода каталитического серина и атомы фтора и фосфоралиганда должны лежать на одной прямой [70].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
