Диссертация (1145807), страница 12
Текст из файла (страница 12)
(а) Зависимость начальной скорости V0 реакции гидролиза НФА,катализируемой альбумином в сайте Садлоу I, от концентрации субстрата [S0],в координатах Лайнуивера-Берка. (б) Зависимость константы скорости первогопорядка kobs предстационарного состояния от начальной концентрациисубстрата [S0] в двойных обратных координатах (для сайта Садлоу II).Исследование ингибиторной активности бис-4-нитрофенилфосфата(НФФ). На первом этапе использовали ингибитор карбоксилэстераз - биснитрофенилфосфат (НФФ). Сначала использовали высокую концентрациюНФФ 100мкМ при концентрации БСА 10мкМ, кинетику гидролиза НФАисследовали при разных концентрациях субстрата. На рис.3.6 представленакинетика гидролиза контрольной и опытной (НФФ 100 мкМ) проб в интервале30мин.66Рисунок 3.6.
Кинетика гидролиза НФА в отсутствие (слева) и в присутствии(справа) 100 мкМ НФФ. Значения концентраций НФА представлены в мкМ.Отмечается заметное снижение скорости реакции в опытных пробах,главным образом за счет снижения "первой начальной скорости" в интервале 045 сек (предстационарное состояние, "всплеск активности"), также видноснижение скорости в интервале 45-330 сек (переходный период), в зависимостиот концентрации субстрата. В более поздний период (330-1950 сек,стационарное состояние) изменения скорости незначительны (табл.3.6, рис.3.7).Следует отметить, что кажущееся значительное снижение скорости приконцентрациях НФА 1 и 3 мкМ в интервале 330-1950 сек обусловлено в первуюочередь истощением субстрата, в меньшей степени возможным влиянием НФФне только на сайт Tyr411, но и на другие центры (псевдо)эстеразной активностиальбумина, в частности на сайт Tyr150 (о чем свидетельствуют данные докингаНФФ, см. раздел 3.5).
При этом важно подчеркнуть, что на максимальнойконцентрации субстрата скорость в интервале 330-1950 сек даже несколькоувеличивается при действии НФФ, что свидетельствует не просто о влиянииНФФ на второй сайт альбумина (Tyr150), но и о возможном аллостерическомусилении активности этого сайта при действии на сайт Tyr411.67330-1950 сек0,050000,008000,040000,006000,030000,02000НФФ 0 мкМ0,01000НФФ 100мкМV, мкмоль/сV, мкмоль/с0 - 45 сек0,00400НФФ 0 мкМ0,00200НФФ 100мкМ0,000000,00000020040НФА, мкМ2040НФА, мкМРисунок 3.7. Скорость гидролиза НФА альбумином (БСА) в начальный (слева)и отдаленный (справа) периоды.Таблица 3.6.Влияние нитрофенилфосфата на скорость гидролиза п-нитрофенилацетатаальбумином (БСА)V, мкмоль/сек (0-45 сек)V, мкмоль/сек (330 -1950 сек)НФА,мкМконтрольНФФ 100мкМконтрольНФФ 100мкМ10,001940,002160,001120,0003530,008830,003460,002170,000967,50,014850,002800,002950,00224150,023890,006250,003810,00395300,037450,010330,006150,00710SlopeНФФ0 мкМ479,7 ±5,36062,13 ±2,550-0,1295НФФ100мкМ2215 ±60,3956,41 ±28,73-0,02547Y-interceptwhen X=0.0X-interceptwhen Y=0.01/slope0,002085 0,0004515Рисунок 3.8.
Определение кинетических характеристик гидролиза пнитрофенилацетата в присутствии ингибитора п-нитрофенилфосфата спомощью программы GraphPad Prism 5.0.68Определение кинетических характеристик фермента, имеющего болееодного центра (псевдо)каталитической активности, является проблемой.«Механическое» применение программ для обработки первичных данных(напр., GraphPad Prism 5.0) может привести к неправильной интерпретациивеличин, характеризующих кинетические характеристики, соответствующие«классической» кинетике Михаэлиса-Ментен (рис.3.8). Однако «качественная»оценка неоспоримо одно: НФФ ингибирует "первую начальную скорость" (винтервале 0-45 сек) по конкурентному типу.Исследование действия ибупрофена и варфарина на эстеразнуюактивность различных видов альбумина.
По данным литературы, ибупрофен(ИБП)являетсяспецифичнымлигандомсайтаСадлоуII(FA3-FA4;субдомен IIIA) [79]. Кроме этого, он обладает аффинностью к сайту FA6(субдомены IIA и IIB), который находится недалеко от места связыванияварфарина. Исследование влияния ИБП на (псевдо)эстеразную активностьальбумина проводили при концентрации альбумина 10мкМ и концентрацияхсубстрата (НФА) 2,5-20 мкМ. ИБП использовали в концентрациях 5, 10, 20, 30мкМ. Регистрацию экстинкций проводили в кинетическом режиме от 0 до 1950сек. На рис.3.9 представлена кинетика гидролиза НФА при взаимодействииБСА с ИБП в концентрациях 5-30 мкМ. Отмечается концентрационнозависимый переход кинетической кривой в прямую линию при действии ИБП,но, в отличие от НФФ, ИБП подавляет исключительно "первую начальнуюскорость", т.е. скорость предстационарного состояния.
Т.е. действие ИБП наальбумин более специфично по сравнению с действием НФФ.Данныеначальной скорости гидролиза НФА при действии разных концентраций ИБПпредставлены в таблице 3.7.Действие варфарина на (псевдо)эстеразную активность БСА исследовалив условиях, аналогичных тем что были в экспериментах с ибупрофеном:концентрация БСА 10 мкМ, НФА – 2,5-20 мкМ, варфарин (ВФ) - 5, 10, 20, 30мкМ. Кинетику гидролиза НФА наблюдали от 0 до 1950 секунд.
На рисунке693.10 представлена кинетика гидролиза пробы в контроле и с 30 мкМ ВФ.Данные скоростей гидролиза представлены в таблице 3.8.ИБП 020,00С, мкМНФА 2,5НФА 5НФА 10НФА 200,000100020003000секИБП 5 мкМС. мкМ20,0010,000,000100020003000секС, мкМИБП 10 мкМ20,0015,0010,005,000,000100020003000секИБП 20 мкМС, мкМ20,0010,000,000100020003000секИБП 30 мкМС, мкМ20,0015,0010,005,000,000100020003000 секРисунок 3.9. Кинетические кривые гидролиза п-нитрофенилацетатаальбумином (БСА) при воздействии разных концентраций ибупрофена (ИБП).70Таблица 3.7.Скорость гидролиза п-нитрофенилацетата альбумином (БСА) в присутствииибупрофена (ИБП)V, мкмоль/секV, мкмоль/секИнтервал 0-60 сек.Интервал 330-1950 сек.НФА,мкМКоличество ибупрофена, мкМКоличество ибупрофена, мкМ0510300510302,5 0,0043 0,0026 0,0011 0,0009 0,0021 0,0019 0,0017 0,001650,0073 0,0047 0,0034 0,0024 0,0027 0,0027 0,0025 0,0026100,0138 0,0116 0,0073 0,0060 0,0036 0,0042 0,0044 0,0047200,0194 0,0172 0,0131 0,0082 0,0055 0,0063 0,0067 0,0077Рисунок 3.10.
Кинетика гидролиза п-нитрофенилацетата альбумином (БСА)с вприсутствии варфарина (30мкМ)Таблица 3.8.Влияние варфарина на скорость гидролиза п-нитрофенилацетата альбуминомБСА (мкмоль/сек)Варфарин, мкМНФА,мкМ05102030Интервал 0-45 сек2,50,00220,00320,00500,00520,004350,00770,00930,00800,00730,0112100,01640,01810,01660,01810,0123200,02450,02670,02370,02800,0185Интервал 330-1950 сек2,50,00180,00180,00200,00200,001650,00240,00240,00260,00270,0021100,00340,00340,00350,00350,0028200,00550,00560,00490,00520,004071В отличие от действия НФФ и ИБП, при действии ВФ характер наклонакинетическихкривыхнараннихстадияхсущественнонеменяется,наблюдается даже тенденция к повышению скорости (особенно при малыхконцентрациях НФА), что может быть обусловлено аллостерическим влияниемВФ на сайт Садлоу II.
В то же время, некоторое снижение скорости гидролизаНФА на второй стадии (стационарная фаза) наблюдается лишь при высокихконцентрациях ВФ и субстрата. Это соответствует данным докинга (см. раздел3.5) об относительно слабой специфичности ВФ по отношению к сайту СадлоуI, но из этого также следует предположение о необходимости использованиянасыщающих концентраций НФА для получения более выраженной динамики.Результаты сравнительных исследований свидетельствуют о том, что всайте Садлоу II сродство ибупрофена максимально у крысиного альбумина, в 2раза меньше у альбумина человека и в 4 раза меньше у бычьего альбумина(табл.
3.9). Анализ данных, полученных при инкубировании всех трех видовальбумина с НФА в присутствии ибупрофена, неожиданно выявил раннеенаступление равновесного состояния и окончание реакции эстеразной реакциив сайте Садлоу I во всех вариантах по сравнению с контролем. Наибольшийэффект ибупрофен оказывал в концентрациях 20 и 30 мкМ. В результатедействия ибупрофена состояние равновесия наступало через 20 минут последобавления субстрата, после чего образование продукта в сайте Садлоу Iпрекращалось. В отличие от сайта Садлоу II, в сайте Садлоу I влияниеибупрофена оказалось максимальным у бычьего альбумина, примерно в 2 разаменьше у крысиного альбумина и в 4 раза меньше – у альбумина человека(табл. 3.9, рис.
3.11а). Хотя, если оценивать мощность ингибирования(ингибирующую способность) ибупрофеном сайта Садлоу I по бимолекулярнойконстанте реакции (ki/Ki), то она максимальна для крысиного альбумина и в 2,53 раза меньше у альбумина человека и быка. Однако, с точки зренияпрактической, первостепенное значение имеют константы равновесия искорости, которые, если судить по взаимодействию с ибупрофеном сайтовСадлоу I и II, более близки у человеческого и крысиного альбумина.72Таблица 3.9.Кинетические характеристики ингибирующего влияния ибупрофена иварфарина на сайты Садлоу I и Садлоу II различных видов альбумина.Концентрация альбумина [E] составляла 10 мкМ, а п-нитрофенилацетата [S] –100 мкМ.
Концентрации ингибитора – 5, 10, 20, 30 мкМЧСАКСAБСAСадлоу II Предстационарный режимИбупрофен88.3 ± 17.6845.9 ± 6.8172.1 ± 28.9Ki, мкМВарфарин———Ki, мкМСадлоу I Стационарный режимИбупрофен:Ki, мкМ2.6 ± 0.94.8 ± 0,619.9 ± 1.5-1ki , с0.0008 ± 0.00010.0027 ± 0.00080.0010 ± 0.00001-1 -1ki / Ki, мМ с0.428 ± 0.1180.561 ± 0.1310.050 ± 0.012ВарфаринKi, мкМ73.3 ± 2.912.4 ± 0.87.0 ± 0.8-1ki , с0.0043 ± 0.00180.0005 ± 0.00004 0.0014 ± 0.0003-1 -1ki / Ki, мМ с0.058 ± 0.0220.036 ± 0.00230.197 ± 0.014Ki – константа диссоциации ингибитора, мкМ; ki – константа скоростиингибирования, с-1Рисунок 3.11.
Зависимость скорости ингибирования kobs эстеразной активностиальбумина в сайте Садлоу I от концентрации ибупрофена (а) и варфарина (б) вдвойных обратных координатах.73Что касается выявленного нами влияния ибупрофена на сайт Садлоу Iвсех видов альбумина, оно может иметь различные причины:1.Связывание ибупрофена с сайтом Садлоу II вызывает локальноеизменение конформации молекулы альбумина. С использованием методовмолекулярного моделирования мы показали (см.
раздел 3.5), что сорбциязомана в сайте Садлоу I облегчает продуктивную сорбцию зомана в сайтеСадлоу II. Возможно, в случае с ибупрофеном имеет место реципрокноеаллостерическоевлияние.Всвязисэтиминтересноотметить,чтоаллостерического влияния варфарина на сайт Садлоу II мы не выявили (см.ниже).2.Всредеприсутствует«суицидальный»ингибитор,которыйпроявляет малую реактивность, однако именно его появление «вскрывает»некий латентный аминокислотный остаток в молекуле фермента, который затемалкилируется и меняет конфигурацию активного центра. Эффект такихингибиторов имеет временную зависимость, высокую специфичность кконкретному остатку и необратимость действия [132]. В ходе реакциипроисходит постепенное истощение фермента.3.Такой же эффект может вызывать «альтернативный» субстратныйингибитор, способный связываться с ферментом слабыми взаимодействиями иобразовывать комплекс EI, который впоследствии образует некий продукт X.Альтернативный субстратный ингибитор обязательно проявляет некоторыесвойства конкурентного ингибитора [132].4.Ингибирование ферментативной реакции продуктом способнодемонстрировать такую кинетику [168], однако данное предположение несогласуется с литературными данными [126, 140].Мы полагаем, что ибупрофен может выступать в роли аллостерическогоингибитора, поскольку обработка и анализ данных не выявили наличия уибупрофена свойств конкурентного ингибитора эстеразной реакции в сайтеСадлоу I.
По данным литературы, варфарин обладает высоким сродством ксайту Садлоу I (FA7) и очень слабым — к сайту FA1 (в субдомене IB) [71]. При74связывании с Садлоу I варфарин образует водородную связь с остатком Tyr150ЧСA, играющим немаловажную роль в ферментативном катализе расщепленияНФА [5]. Согласно полученным нами данным, наибольшим сродствомварфарин обладает к сайту Садлоу I крысиного альбумина, тогда как к Садлоу IBSA и HSA сродство в 150-200 раз меньше. Однако наибольшуюингибирующую способность, характеризуемую соотношением максимальнойскоростиингибированиякконстантедиссоциации(ki/Ki),варфариндемонстрировал с альбумином человека (рис. 3.11б), далее следует крысиныйальбумин (в 1,5-2 раза меньше) и бычий альбумин (в 3 раза меньше).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
