Диссертация (1145807), страница 16
Текст из файла (страница 16)
с перенесенным протоном с гидроксила тирозина 411 нааммонийную группу лизина 414, показал, что все изомеры зомана связываютсяс активированным сайтом с одинаковой эффективностью, кроме P(+)C(+)изомера, который связывается с сайтом с худшей эффективностью. Но толькодля P(+)C(-) и P(+)C(+) изомеров найдены конформеры, удовлетворяющие всемусловиям продуктивности: расстояние между атомом водорода ОН-группытирозина и атомом фосфора лиганда не превышает 0,37 нм и атомы кислородатирозина, фтора и фосфора зомана лежат на одной прямой.Рисунок 3.22. P(+)C(-)-стереоизомер зомана, сорбированный в сайтах ЧСАTyr411 (а,б) и Tyr150 (в,г) в состояниях протонирования 1 (а,в) и 2 (б,г).Докинг зомана в сайт Tyr150 альбумина. Анализ комплексов зомана всайте Tyr150 при протонировании остатка тирозина выявил, что всестереоизомеры связываются с гидроксилом тирозина в одном положенииотносительно тирозина, а расстояние между гидроксильным атомом кислородатирозина и атомом фосфора зомана варьирует от 0.33 до 0.36 нм (рис.
3.22в). Kd95для P(+)-стереоизомеров выше, чем для P(-)-изомеров. Эти результатыпредставляются весьма важными, с учетом того, что P(-)-изомеры зомана болеетоксичны[31].C(-)-исвязываются с одинаковойC(+)-энантиомерыэффективностью. В целом, согласно полученным нами данным, зоман (причемнаиболее токсичные его энантиомеры) лучше связывается с сайтом «Tyr150»,чем с сайтом «Tyr411».
В комплексах зомана в сайте «Tyr150» в состояниипротонирования 2 все стереоизомеры также сорбируются в одинаковойпозиции, значение dist(P-O) варьирует от 0.33 до 0.34 нм (рис. 3.22г). Во всехполученных комплексах атомы кислорода тирозина, фтора и фосфора зоманалежат на одной прямой. Геометрия всех полученных комплексов удовлетворяетвсем параметрам продуктивности.
В целом, по данным докинга, зоман содинаковойэффективностьюсвязываетсясактивированныминеактивированным сайтом Tyr150. Таким образом, не было обнаруженовлияния состояния протонирования сайта Tyr150 на значения dist(P-O) и Kd.Все комплексы зомана с сайтом Tyr150 могут считаться продуктивными погеометрическимпараметрам.Прослеживаетсянезначительнаястереоселективность сайта Tyr411 по отношению к Р(-) стереоизомерам зомана,тогда как для сайта Tyr150 эта стереоселективность ярко выражена. Однакометод докинга не учитывает такие факторы как стерическое влияние молекулводы и подвижность белка, которые могут повлиять на процесс взаимодействиябелка с лигандом.
Молекула альбумина имеет достаточно лабильнуюструктуру,которойприсущитакиеэффектыкаккооперативностьиаллостерическая модуляция, обычно свойственные мультимерным белкам. Дляисследованияаллостерическоймодуляциивмолекулеальбуминамыисследовали влияние сорбции зомана в сайте Tyr150 на сорбцию зомана в сайтеTyr411.Аллостерическая модуляция Tyr411. Докинг изомеров зомана в сайтTyr411 комплекса альбумина с сорбированным в активированном сайте Tyr150изомером P(-)C(-) был проведен после 1000 пикосекунд симуляции этого96комплекса методом молекулярной динамики. Результаты представлены втаблице 3.16.Таблица 3.16.Результаты молекулярного докинга четырех изомеров зомана внеактивированный сайт Tyr411 комплекса альбумина с сорбированнымзоманом P(-)C(-) в сайте Tyr150НаименованиеСтереоизомеры зоманасайтаХарактеристикиP(-)C(-)P(+)C(-) P(-)C(+) P(+)C(+)связывания и взаимодействияего состояниеKd (µM)3610,02680,01980,02050,0геометрия411дададада(на одной прямой?)неактивирован dist_O-P (нм)0,340,310,320,32оценкададададапродуктивностиАнализполученныхстереоизомеровзоманаданныхпоказал,полученныечтокомплексыдлявсехмогутчетырехсчитатьсяпродуктивными, расстояние между фосфором лиганда и гидроксилом тирозинаварьирует от 0,31 до 0,34 нм.
Атомы фтора и фосфора лиганда и гидроксильныйатом кислорода тирозина лежат на одной прямой во всех случаях. Тот факт, чтов этом случае молекула зомана имеет возможность сорбироваться в сайтеTyr411 намного ближе к тирозину, чем в случае свободного белка, может бытьобъяснен тем, что за 1000 пс симуляции комплекса [зоман--Tyr150] происходятконформационныеизменениявглобуле,приводящиекувеличениюстерических размеров сайта Tyr411 либо к перераспределению зарядоваминокислот. Таким образом, сорбция зомана в сайте Tyr150 облегчаетпродуктивную сорбцию зомана в сайте Tyr411, но при этом константыдиссоциации все равно на порядок выше, чем для продуктивного связывания всайте Tyr150 и непродуктивного в сайте Tyr411.
Это свидетельствует онебольшом времени жизни такого продуктивного комплекса и, следовательно,о низкой эффективности (псевдо)холинэстеразной активности сайта Tyr411.Молекулярная динамика комплексов зомана с альбумином. Известно, чтовремя, необходимое для образования ковалентной связи, не превышает 1097пикосекунд [50, 167]. Чтобы проверить стабильность полученных методомдокинга комплексов альбумина с зоманом, был проведен расчет траекторийдвижения атомов методом молекулярной динамики. Продолжительностьсимуляции (длина траекторий) составила 1000 пикосекунд. По полученнымтраекториям была построена зависимость расстояния dist(O-P) от времени.Анализ полученных траекторий показал, что комплексы стереоизомеровзомана с сайтом Tyr411 в обоих состояниях протонирования нестабильны.
Впроцессе симуляции расстояние между атомом кислорода тирозина и атомомфосфора зомана (значение dist(P-O)) не опускалось ниже 0.38 нм. Отсюдаследует вывод, что структурных изменений данных комплексов недостаточнодля образования продуктивного фермент-лигандного комплекса. По всейвидимости, для гидролиза зомана в сайте Tyr411 необходимы химическиеизменения в структуре самого сайта, возможно, перенос протона на другиеаминокислоты.
Комплексы зомана с неактивированным сайтом Tyr150 (всостоянии протонирования 1) также нестабильны. За весь период симуляции ниу одного из изомеров расстояние (O-P) не опускается ниже 0,38 нм надостаточное для реакции время. Результат свидетельствует в пользу гипотезы отом, что для прохождения реакции гидролиза в сайте Tyr150 также необходимаактивация аминокислот сайта, а именно перенос протона с тирозина нагистидин.Молекулярнаядинамикакомплексовизомеровзоманасактивированным сайтом Tyr150 показаны на рисунке 3.23а и более подробнопервые 20 пс симуляции на рисунке 3.23б.
Результаты молекулярной динамикикомплексов изомеров зомана в сайте Tyr150 в состоянии протонирования 2отличаются в зависимости от вида изомера лиганда. Комплексы альбумина сP(+)-изомерами зомана нестабильны, значение dist(P-O) не опускается ниже0.38 нм на протяжении всего периода симуляции, тогда как комплексы белка сP(-)-стереоизомерами зомана стабильны на протяжении 20 пс, что являетсядостаточным временем для реакции стехиометирического (фосфонилирование)и/или каталитического взаимодейтвия с тирозином.98абРисунок 3.23.
(а) Зависимость расстояния между гидроксильным кислородомактивированного Tyr150 и атомом фосфора четырех изомеров зомана (dist_O-P)от времени. (б) Зависимость расстояния между гидроксильным кислородомактивированного Tyr150 и атомом фосфора четырех изомеров зомана отвремени (первые 20 сек симуляции).На основании полученных результатов можно сделать следующиевыводы и предположения: зоман с лучшей эффективностью взаимодействует с сайтом Tyr150; для фосфонилирования сайта Tyr411 необходимы либо химическиеизменения в структуре сайта, либо связывание зомана в других сайтах, т.к.расчет показал, что перенос протона с Tyr411 на Lys414 не являетсядостаточным условием для образования продуктивного фермент-лигандногокомплекса; для образования продуктивного фермент-лигандного комплекса зомана ссайтом Tyr150 необходим перенос протона с Tyr150 на His242; к переносу протона может приводить связывание зомана в других сайтах(аллостерическая модуляция).Связывание зомана в других возможных сайтах ацетилированияальбумина.
Ранее было показано, что 82 а.о. молекулы альбумина могут бытьацетилированы при взаимодействии с п-нитрофенилацетатом [126]. В нашемисследовании окружение этих аминокислот, а также других возможных сайтоввзаимодействия с зоманом (всех остальных серинов, лизинов, треонинов итирозиновмолекулыальбумина)былопроанализированонаналичие99возможных акцепторов протона, которые могли бы работать аналогичногистидинувкаталитическойтриадеАХЭ,принимающемупротонскаталитического серина. После предварительного пилотного тестирования длядальнейшей проверки были отобраны 40 сайтов (11 лизинов: 12, 181, 225, 233,240, 262, 274, 276, 313, 317, 402; 12 серинов: 65, 83, 192, 193, 202, 270, 273, 287,312, 435, 454, 474; 9 треонинов: 68, 76, 79, 125, 243, 420, 467, 527, 540; 8тирозинов: 84, 148, 161, 263, 319, 334, 341, 370).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
