Диссертация (1145807), страница 18
Текст из файла (страница 18)
На следующем этапе исследований былпроведенмолекулярныйдокинглигандов(варфарин,ибупрофен,п-нитрофенилацетат, бис-(п-нитрофенил)фосфат) в сайты альбумина Tyr150,Tyr411 и Cys34 с помощью программного пакета Autodock4.0. В исследуемомцентре связывания белка строили решетку аппроксимации размером 60 узлов вx-, y-, и z-направлении и с шагом 0,0375 нм. В качестве поиска оптимальныйконформаций комплекса альбумин-лиганд был использован ламарковскийгенетический алгоритм. Процедуру поиска повторяли 50 раз для каждой парыбелок-лиганд. Итоговые конформации комплексов, RMSD которых непревышал 0,05 нм, объединяли в кластеры и сортировали по возрастанию Kd.Конформации с минимальными константами ингибирования отбирали вкачестве результата докинга.
Трехмерные молекулы лигандов были построеныи затем минимизированы методом скорейшего спуска с помощью программыHyperChem 8.0 [96]. Использовались три модели трехмерной структуры белка:1) данные рентгеноструктурного анализа комплекса молекулы альбуминачеловека с молекулой варфарина, сорбированной в сайте Tyr150 (код в базеданных белковых структур 2bxd); молекулы воды и лигандов были удалены изструктуры;2) данные рентгеноструктурного анализа молекулы комплексаальбумина человека с молекулой ибупрофена, сорбированной в сайте Tyr411(код в базе данных белковых структур 2bxg); молекулы воды и лигандов былиудалены из структуры;3) «расслабленный» белок: из трехмерной моделикомплекса альбумина с варфарином (код в базе данных белковых структур2bxd) были удалены молекулы лиганда и воды, затем молекула альбумина быламинимизирована методом скорейшего спуска, после чего была проведена такназываемая «утряска» молекулы белка методом молекулярной динамики спомощью программного пакета Gromacs; длина траектории составила 1 нс.105ВзаимодействиеЧСАсп-нитрофенилацетатом.Былпроведенмолекулярный докинг НФА в сайты Tyr150 и Tyr411, результаты представленыв табл.
3.19. Для оценки продуктивности взаимодействия использовали 2величины – Kd комплекса и расстояние между гидроксильным кислородомтирозина и атомом углерода лиганда. Ни одна из найденных конформацийкомплекса НФА с сайтом Tyr150 "расслабленного" белка не являетсяпродуктивной, минимальное расстояние между кислородом тирозина икарбонильным атомом лиганда составляет 4.6 Å. Со структурами из базыданных белков НФА связывается эффективно, полученные конформацииявляютсяпродуктивными,причемпродуктивностьвзаимодействиясо"структурированным" альбумином примерно в 2 раза выше для сайта Tyr150,по сравнению с сайтом Tyr411.
Кроме того, связывание ибупрофена в сайтеTyr411 положительно влияет на сорбцию НФА в сайте Tyr150, дополнительноповышая вероятность продуктивного взаимодействия.Таблица 3.19.Результаты молекулярного докинга НФА в сайты Tyr150 и Tyr411 ЧСАKd, мкМ;2bxgрасстояние2bxd (рентгенРасслаб(рентген скислород тирозинас варфариномлиганд сайтленныйибупрофеном- углеродв сайтебелокв сайтекарбонильногоTyr150)Tyr411)лиганда, ÅKd101.255.235150расстояние4.63.33.6НФАKd92.713662.7411расстояние4.168.7Для сайта Tyr411 не было обнаружено продуктивных конформаций нидля одного варианта структуры альбумина, расстояние между тирозином иатомом углерода везде превышает 4 Å.
Графический анализ показал, что, как ив случае с НФФ, у Tyr411 большее сродство к нитрогруппе НФА, чем к егоацильной части. Полученные данные докинга несколько неожиданны и, напервый взгляд, противоречат представлениям о том, что основным сайтомэстеразной активности альбумина является Tyr411, тогда как Tyr150 не входит106даже в перечень ацетилированных тирозинов при "тотальном" насыщенииальбумина ацетильными группами (при этом ацетилируются 4 тирозина: Tyr84,Tyr161, Tyr401, Tyr411) [126]. С другой стороны, эти данные не противоречатимеющимся сведениям о наличии у тирозина двух сайтов с эстеразнойактивностью, один из которых может обладать "истинно" эстеразнойактивностью. О том, что гидролиз альбумином эфиров, в частности НФА, малочем отличается от классического гидролиза, впервые заявили Casida &Augustinsson еще в 1959 г.
[46]. Так, они установили, что кажущаяся Kdкомплексаальбумин-(п-нитрофенил-N-метилкарбамат)равна1,4*10-4М,подчеркивая при этом, что эта величина соответствует величине Ks многихдругих эстераз. Кроме того, исследуя кинетику гидролиза НФА, они показали,что оба продукта реакции - ацетат и п-нитрофенол - высвобождаются всоотношении1:1,апослеполногогидролизаоднойпорцииНФАферментативная активность альбумина не только не исчезает совсем, но дажене уменьшается при добавлении следующей порции [46].
Наконец, они впервыезаявили о том, что кинетика реакции гидролиза эфиров альбуминомсоответствует кинетике Михаэлиса-Ментен с образованием промежуточногокомплекса [142]. Можно предположить, что, из двух сайтов взаимодействия сНФА и ФОС, Тир150 (сайт Садлоу I) проявляет "истинно" эстеразнуюактивность, а Тир411 (сайт Садлоу II) - псевдоэстеразную. На самом деле такоеразделение в достаточной степени условно, скорее всего, в обоих случаях имеетместо образование промежуточного ковалентного аддукта, а отличия состоят вовремени жизни этого аддукта, т.е. разница состоит в константе k3,характеризующей реакцию деацетилирования.Взаимодействие альбумина с ибупрофеном и варфарином. Результатыпредставлены в табл. 3.20, на рис.
3.23 и 3.24. Для оценки эффективностивзаимодействия использовали Kd, мкМ, и расстояние от кислорода тирозина доближайшего атома лиганда. Результаты докинга в структуры из базы данныхбелковыхструктурполностьюсовпадаютсрезультатамиРСА,чтоподтверждает достоверность примененного подхода. Как ибупрофен, так и107варфарин эффективно связываются с обоими сайтами – значения Kd варьируютот 1 до 58 мкМ. Ибупрофен демонстрирует бóльшую специфичность к сайтуTyr411, чем варфарин к сайту Tyr150, хотя для «расслабленного» белкаконстанты связывания идентичны.
Сорбция варфарина в сайте Tyr150 влияет насвязывание ибупрофена в сайте Tyr411 (расстояние составляет 3.5Å посравнению с «рентгеноструктурными» 2.7Å). Связывание ибупрофена в сайтеTyr411 также ухудшает эффективность связывания варфарина в сайте Tyr150 (3мкМ и 4.9Å против «рентгеновских» значений 2мкМ и 3Å). Для ибупрофенавыявлено значительное различие в значениях констант для расслабленногобелка и для «рентгеновских» моделей, тогда как для варфарина различиянесущественны. Это свидетельствует о том, что эффективность связыванияибупрофена чувствительна к изменениям конформации белка, а значит,ибупрофен более специфичен, чем варфарин.Таблица 3.20.Результаты молекулярного докинга ибупрофена и варфарина в сайтысвязывания Tyr150 и Tyr411Kd, мкМ;2bxg2bxd (рентгенрасстояниеРасслаб(рентген сс варфариномкислородленныйибупрофев сайтетирозина белокном в сайтеTyr150)ближ. атом, ÅTyr411)ибупрофен 150Kd582616расстояние3.55.93.9411Kd50442.7 (совп.
срасстояние6.23.5рентгеном)варфарин150Kd8233 (совп. срасстояние2.64.9рентгеном)411Kd221расстояние3.33.63.3108Рисунок 3.24. Варфарин, сорбированный в сайтах Tyr411 и Tyr150 в"расслабленной" и "рентгеновской" структурах ЧСА.Рисунок 3.25. Ибупрофен, сорбированный в сайтах Tyr411 и Tyr150 в"расслабленной" и "рентгеновской" структурах ЧСА.109Взаимодействие альбумина с бис-(п-нитрофенил)фосфатом. Проведенмолекулярный докинг НФФ в сайты Tyr150 и Tyr411, результаты представленыв таблице 3.21 и на рисунке 3.25.
НФФ связывается эффективно только ссайтом Tyr150, для сайта Tyr411 не было обнаружено продуктивныхконформаций ни для одного варианта структуры альбумина (расстояние междутирозином и атомом фосфора везде превышает 5Å, при таких расстоянияхневозможно образование стабильного комплекса белок-лиганд). Графическийанализ показал, что у Tyr411 большее сродство к нитрогруппе НФФ, нежели кего фосфорильной части. Очевидно, влияние НФФ на сайт Садлоу II (см.
раздел3.4, рис. 3.17) обеспечивает именно нитрогруппа НФФ. Следует отметить, чтосвязывание ибупрофена в сайте Tyr411 положительно влияет на связываниеНФФ в сайте Tyr150 (для свободного белка Kd составляет 0.4мкМ и расстояние– 4.3Å, а после связывания ибупрофена значения меняются на 0.2мкМ и 3.7Å,соответственно).Таблица 3.21.Результаты молекулярного докинга бис-(п-нитрофенил)фосфата в сайтысвязывания Tyr150 и Tyr4112bxd (рентген 2bxg (рентгенKd, мкМ;Расслабленны с варфариномс ибупрофеdist (O-P), Åй белокв сайтеном в сайтеTyr150)Tyr411)НФФ150Ki0.4580.2411РасстояниеKi4.333.5153.74расстояние7.55.96.1110Рисунок 3.26.
Бис-(п-нитрофенил)фосфат, сорбированный в сайтах Tyr411 иTyr150 в "расслабленной" и "рентгеновской" структурах альбумина.3.6. Сравнительный анализ in silico связывания параоксона ссывороточным альбумином человека и быка.Вэкспериментахinvitro,направленныхнаисследование(псевдо)эстеразной активности альбумина по отношению к ФОС, используетсякак человеческий [121,160], так и бычий [173, 199] сывороточный альбумин(БСА). Первичные последовательности ЧСА и БСА гомологичны на 76% [93], асайтам Tyr411 и Tyr150 в молекуле ЧСА соответствуют сайты Tyr410 и Tyr149в молекуле БСА [93]. Тем не менее, имеются данные о том, что эффективностьвзаимодействия с ксенобиотиками различается для этих двух белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
