Диссертация (1145807), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Согласно расчету для одного сайта связывания, Bmax=231,9±6,5мкМ иKd=46,1±6,2мкМ;длядвухсайтовсвязыванияBmax1=37,8±5,5мкМ,127Kd1=3,2±1,2мкМ, Bmax2=211,3±22,1мкМ, Kd2=90,1±12,4мкМ. По результатамприменения формализма Михаэлиса-Ментен ко всему диапазону исследуемых-1концентраций зомана, Km=4,1мкМ, Vmax=0,013мкМ∙мин . При разделении надва диапазона концентраций (точка раздела 0,56 мкМ) показатели для условно-1«низких» концентраций: Km1=0,166мкМ, Vmax1=0,0014мкМ∙мин ; для условно-1«высоких»: Km2 =46,3мкМ, Vmax2 =0,09мкМ∙мин .
Уточнение этих показателейвозможно, во-первых, при работе с насыщающими концентрациями зомана (аэто означает существенное превышение – на несколько порядков токсикологически релевантных концентраций), во-вторых, путем измеренияскоростейобразованиядвухпродуктовреакции-фторид-ионаипинаколилметилфосфоновой кислоты – в рамках одного эксперимента сиспользованиемселективныхингибиторовипрецизионныххимико-аналитических методов.
Трудности интерпретации и соотнесения полученныхданных с тем или иным сайтом обусловлены необходимостью работы сненасыщающими концентрациями зомана. Мы полагаем, что показатели,свидетельствующие о более высоком сродстве с низкой скоростью реакции иконечной емкостью (Km1, Kd1, Vmax1, Bmax1), характеризуют сайт Садлоу II, тогдакак показатели, свидетельствующие о более низком сродстве с высокойскоростью реакции и конечной емкостью (Km2, Kd2, Vmax2, Bmax2), характеризуютсайт Садлоу I. Подтверждение этих предположений мы попытались найти вэкспериментах in silico.Поданным молекулярногодокинга, зоманипараоксонлучшесвязываются с Tyr150, чем с Tyr411 ЧСА. Депротонирование тирозинанеобходимо для продуктивного связывания зомана с Tyr411, но в гораздоменьшей степени активация тирозина влияет на геометрию связывания зоманас Tyr150 ЧСА.
Сорбция зомана в сайте Tyr150 облегчает продуктивнуюсорбцию зомана в сайте Tyr411, но при этом константы диссоциации все равнона порядок выше, чем для продуктивного связывания в сайте Tyr150 инепродуктивного в сайте Tyr411. Это свидетельствует о небольшом времени128жизнитакогопродуктивногокомплексаи,следовательно,онизкойэффективности (псевдо)холинэстеразной активности сайта Tyr411. ПомимоTyr150 и Tyr411, с ФОС могут взаимодействовать Ser193 и Lys402. Докингчетырех стереоизомеров зомана в эти центры связывания показал, что толькоP(-)-изомерызомана(обусловливающиееговысокуютоксичность)связываются с этими сайтами на расстоянии, достаточно близком длянуклеофильной атаки кислородом или азотом фосфора зомана.
Очевидно, сайтСадлоу I (включающий в себя Tyr150 и Ser193 ЧСА) отвечает за истинноэстеразную активность альбумина по отношению к ФОС. Установленыконстанты диссоциации и проведен анализ реципрокного влияния основныхсайтов альбумина при взаимодействии с известными негидролизуемымилигандами (варфарин, ибупрофен, НФФ).
Так, связывание ибупрофена с Tyr411снижает продуктивность взаимодействия параоксона с Tyr150; связывание жеварфарина c Tyr150, наоборот, повышает продуктивность взаимодействияпараоксона с Tyr411. Установлено, что параоксон имеет близкие контакты состатком Lys190, который может быть включен в список возможных сайтовэстеразной активности альбумина. В ближайшем окружении Lys190 находитсятакже боковой радикал остатка Glu425, способного акцептировать протон состатка лизина.Кроме того, мы предположили участие Lys414 в Садлоу-сайте II и His242в Садлоу-сайте I альбумина в качестве акцепторов протонов от остатковтирозинаTyr411иTyr150,соответственно,основываясьнаданныхкомпьютерного моделирования взаимодействия зомана с ЧСА. Таким образом,возможно, что для гидролиза альбумином некоторых субстратов необходимакаталитическая диада His-Tyr или Lys-Tyr, в которой остатки гистидина илилизина выполняют функцию кислотного остатка; такие случаи описаны влитературе, с тем отличием, что два разных остатка гистидина выполняютфункции кислотного и основного остатков [68].
С учетом анализа этих и другихлитературных данных, можно предположить, что из двух главных сайтов,взаимодействующих с НФA и ФОС, сайт Садлоу I с остатком Tyr150 проявляет129"истинно" эстеразную активность, а сайт Садлоу II с остатком Tyr411 псевдоэстеразную. Такое разделение может оказаться достаточно условным,если будет установлено, что в обоих случаях имеет место образованиепромежуточного ковалентного аддукта, а отличия состоят во времени жизниэтого аддукта, т.е.
разница состоит в константе k3, характеризующей реакциюдеацилирования.Исследование взаимодействия альбумина (ЧСА) с НФА посредствоммолекулярного докинга позволило установить, что полученные конформацииявляютсяпродуктивными,причемпродуктивностьвзаимодействиясо"структурированным" альбумином примерно в 2 раза выше для сайта Tyr150,по сравнению с сайтом Tyr411. Кроме того, связывание ибупрофена в сайтеTyr411 положительно влияет на сорбцию НФА в сайте Tyr150, дополнительноповышая вероятность продуктивного взаимодействия.
У Tyr411 большеесродство книтрогруппе НФА, нежели к его ацильной части. Ибупрофендемонстрирует бóльшую специфичность к сайту Tyr411, чем варфарин – ксайту Tyr150. Для ибупрофена выявлено значительное различие в значенияхконстант для расслабленного белка и для «рентгеновских» моделей, тогда какдля варфарина различия несущественны.
Это свидетельствует о том, чтоэффективностьсвязыванияибупрофеначувствительнакизменениямконформации белка, а значит, ибупрофен более специфичен, чем варфарин.Сравнительный анализ взаимодействия параоксона с ЧСА и БСАметодами молекулярного моделирования показал, что сайт Tyr411(410) былменее подвержен эволюционным изменениям: аминокислоты, принимающиеучасти е в связывании параоксона в этом сайте (Tyr411(410), Arg410(409),Lys414(413), Arg257(256)) консервативны. И для ЧСА, и для БСА, сайтTyr411(410) является основным сайтом фосфорилирования: для продуктивногосвязывания молекулы ФОС и реакции фосфорилирования не требуетсядополнительных условий (связывания модуляторов в других сайтах) и,согласно данным молекулярной динамики, механизм этого процесса одинаковдля обоих белков. Эти данные согласуются с данными наших исследований130взаимодействия ЧСА с зоманом.
Сайт Tyr150(149) менее консервативен. Вобоих белках в связывании параоксона принимает участие ближайший ккаталитическомутирозину аргинин, образующийводородныесвязисмолекулой лиганда. В молекуле ЧСА – это Arg222, в молекуле БСА – Arg198.Эти аргинины расположены «зеркально» относительно Tyr150(149), поэтомудля жестких молекул или для оптически активных соединений можно ожидатьразличную эффективность связывания в этом сайте. И для ЧСА, и для БСА,продуктивное связывание ФОС в сайте Tyr150(149) возможно только послеизменений в структуре альбумина (либо перенос протона с остаткакаталитического тирозина на имидазольное кольцо соседнего гистидина His242(241), либо конформационные изменения, вызванные связыванием лигандав других сайтах). Согласно полученным нами данным, в стабильныхкомплексах альбумина с непродуктивно связанным в сайте Tyr150(149)параоксоном положение боковых радикалов аминокислот сайта различно дляЧСА и БСА.
Это может быть связано с разным распределением зарядов вмолекулах этих белков: суммарный заряд молекулы ЧСА составляет -14e, аБСА – -16e. Окисление цистеина также может влиять на распределение зарядоввнутри молекулы альбумина, а, значит, на конформацию сайта Tyr150(149) и наэффективность связывания молекул в этом сайте. Механизм модуляции сайтаTyr150(149) требует дальнейших исследований.Таким образом, результаты исследований in vitro и in silico могутпоказаться противоречивыми, однако, понимая специфику молекулярногомоделирования и руководствуясь схемой взаимодействия с образованиемфермент-субстратного комплекса в обоих сайтах Садлоу, противоречияснимаются. Метод докинга не учитывает такие факторы как стерическоевлияние молекул воды и подвижность белка, которые могут повлиять напроцесс взаимодействия белка с лигандом. Т.е.
он имеет дело преимущественосо второй стадией – собственно ацилирования, и практически не учитываетстадию первичного взаимодействия лиганда с альбумином в растворе.Биохимия in vitro дает возможность судить и о первой, и о третьей стадии131взаимодействия(деацилирование).Совмещениеэтихданныхдаетпредставление о «первичном» сродстве (Ks) и вероятности ацилирования (Kd)сайтовСадлоу.Согласнополученнымданным,альбуминпритоксикологически релевантных концентрациях связывается с сайтом Садлоу II,который будет выступать в качестве транспортного средства и легко «сбросит»пассажира, если на пути встретится холинэстераза, имеющая более высокоесродство к параоксону.
Сайт Садлоу I нельзя всерьез рассматривать как местокаталитической детоксикации параоксона (и других высокотоксичных ФОС),несмотря на низкую константу диссоциации, т.к. низкое сродство на входе непозволяет этому сайту реализовать свои возможности.Таблица 4.1.Расчетные константы (серый фон) сайтов Садлоу на основании «совмещения»данных, полученных в экспериментах с параоксоном in vitro и in silicoСайтыКонстанты, мкМЧСАБСАKs3.990.86Садлоу IIKd8713appKm90.9913.86appKm801.6447.7Садлоу IKd49Ks797.6438.7По результатам нашей работы возможно несколько взаимодополняющихвариантов повышения эффективности антидотной терапии отравлений ФОС: 1)усиление первичной аффинности и каталитической эффективности сайтаСадлоу I; 2) повышение сродства к ФОС сайта Садлоу II на второй стадиивзаимодействияиэффективностистехиометрическойдетоксикации;3)уменьшение сродства к ФОС сайтов Садлоу, с тем чтобы (а) не допуститьтранспортировку ФОС к АХЭ нейромышечных и нейрональных синапсов и (б)повыситьэффективностьсвязыванияинейтрализациистехиометрическими ловушками (БХЭ, антитела, аптамеры).молекулФОС132ВЫВОДЫ1) Сайт Садлоу I КСА обладает наибольшей каталитической эффективностьюпо отношению к п-нитрофенилацетату, которая в 2 раза выше эффективностиЧСА и в 5 раз - БСА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
