Диссертация (1145807), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Стабильность иконформационные изменения четырех отобранных комплексов альбуминпараоксон были изучены методом молекулярной динамики. Длина всехтраекторий составила 10 нс. По полученным траекториям была рассчитаназависимостьвеличинсреднеквадратичныхотклонений(RMSD)аминокислотных остатков альбумина от времени. Для всех комплексовзначение RMSD для аминокислотных остатков увеличивалось в течение первых3 нс симуляции, затем выходило на плато и варьировало в диапазоне 0.4 – 0.5нм, что указывает на стабилизацию полипептидной цепи молекулы альбумина.Исключение составил комплекс БСА со связанной в сайте Tyr410 молекулойпараоксона: для этого комплекса значение RMSD вышло на плато после 8 нссимуляции. По полученным траекториям была рассчитана зависимостьрасстояния между атомом фосфора параоксона и гидроксильным атомомкислорода тирозинов dist(O-P). Результаты представлены на рисунке 3.27.Анализ полученных данных показал, что комплекс ЧСА со связанноймолекулой параоксона в сайте Tyr150 нестабилен (рисунок 3.27).
Значениеdist(O-P) первые 2 нс симуляции колеблется в промежутке 0.4-1.0 нм, затемоставшиеся 8 нс симуляции остается неизменным и колеблется незначительнона уровне 0.6 нм. Анализ положения молекулы параоксона на этом участкетраектории показал, что лиганд «зафиксирован» кулоновским взаимодействиеммежду атомом фосфорильного кислорода параоксона и боковым радикалом117аминокислотного остатка Arg257.
Следует отметить, что в молекуле БСА в этойпозиции также находится аминокислотный остаток аргинина.абРисунок 3.28. Зависимость от времени расстояния между атомом фосфорапараоксона и гидроксильным атомом Тyr150(149) (а) и Tyr411(410) (б)ЧСА (светлым) и БСА (темным).Согласно данным [126], существует 82 аминокислоты, которые могутбыть ацетилированы НФА, а, значит, теоретически могут взаимодействовать ис ФОС.
Как было установлено ранее, чтобы реакция фосфорилирования моглапроизойти, расстояние между атомом фосфора лиганда и каталитическиматомом фермента не должно превышать 0,4 нм [193]. Поэтому был проведенанализ аминокислотного окружения атома фосфора параоксона, которыйвыявил, что в пределах указанного расстояния нет ни одной аминокислоты,способной на образование ковалентной связи с молекулой лиганда.Комплекс БСА со связанной молекулой параоксона в сайте Tyr149 такженестабилен (рисунок 3.27а).
Значение dist(O-P) за первые 2 нс увеличивается доуровня 0.6 нм и остается неизменным оставшиеся 8 нс. Анализ положениямолекулы параоксона на этом участке траектории показал, что лиганд118«зафиксирован» водородной связью между фосфорильным кислородомпараоксона и атомом H2 остатка His241, а NO2 группа – кулоновскимвзаимодействием между атомом N лиганда и атомом O1 остатка Gln195. Вмолекуле ЧСА в этих позициях находятся аминокислотные остатки гистидина иглутамина, соответственно. Как и в ЧСА, анализ аминокислотного окруженияпараоксона в комплексе с БСА выявил, что в пределах 0.4 нм от атома фосфоралиганда нет ни одной аминокислоты, способной на образование ковалентнойсвязи с молекулой параоксона.Таким образом, устойчивое положение параоксона в сайтах Tyr150 ЧСА иTyr149 БСА не совпадает, несмотря на консервативность ближайшегоаминокислотного окружения каталитического тирозина. Графический анализвыявил, что в случае БСА аминокислоты сайта Tyr149 расположены болеекомпактно относительно друг друга, из-за чего стерический размер данногосайта связывания меньше в молекуле БСА по сравнению с молекулой ЧСА.Но и для ЧСА, и для БСА образование ковалентной связимеждупараоксоном и Tyr150(149) невозможно в свободном немодифицированномбелке.
Согласно ранее полученным данным, триггером, улучшающим сродствосайта Tyr150(149) к ФОС, может служить либо перенос протона с остаткакаталитического тирозина на имидазольное кольцо соседнего гистидина His242(241) [5], либо модуляция сайта эндогенными лигандами, например,жирными кислотами [3].Зависимостьрасстояниямеждуатомомфосфорапараоксонаигидроксильным атомом тирозина в комплексах параоксона с сайтамиTyr411(410) от времени представлена на рисунке 3.27б. Динамика этойзависимости схожа для ЧСА и БСА: участки «стабильности», на которыхрасстояние колеблется в пределах 0.37-0.40 нм, чередуются с участками«нестабильности»,накоторыхмолекулапараоксонаотдаляетсяоткаталитического тирозина.Графический анализ показал, что на всех «стабильных» участках, как дляЧСА, так и для БСА, положение параоксона одинаково: молекула лиганда119стабилизируется образованием водородной связи между группой ОН тирозинаифосфорильнымрасстояниямеждуфосфорильныматомомкислородагидроксильныматомомкислородапараоксона.Анализатомомводородалигандапоказал,зависимостиTyr11(410)чтоипериоды«стабильности» положения параоксона в сайте связывания совпадают спериодами существования водородной связи между этими атомами.
Аувеличению расстояния между параоксоном и тирозином, то есть уходупараоксона из сайта связывания, предшествует разрыв этой водородной связи.Для обоих белков существуют участки «стабильности», на которых расстояниемежду атомом фосфора параоксона и гидроксильным атомом кислородакаталитического тирозина достаточно близкое для образования ковалентнойсвязи между лигандом и белком [193].Таким образом, согласно полученным данным, сайт Tyr411(410) болееконсервативен:аминокислоты,принимающиеучастиевсвязываниипараоксона в этом сайте (Tyr411(410), Arg410(409), Lys414(413), Arg257(256))консервативны. И для ЧСА, и для БСА, сайт Tyr411(410) является первичнымсайтом фосфорилирования: для продуктивного связывания молекулы ФОС иреакции фосфорилирования не требуется дополнительных условий (связываниямодуляторов в других сайтах) и, согласно данным молекулярной динамики,механизм этого процесса одинаков для обоих белков.
Эти данные согласуютсяс данными предыдущих исследований [2, 5, 6] и с экспериментами in vitro [121,197]. Поэтому для необратимого связывания ФОС без дополнительныхмодуляторов можно ожидать схожие результаты для ЧСА и БСА.Сайт Tyr150(149) менее консервативен. В обоих белках в связываниипараоксона принимает участие ближайший к каталитическому тирозинуаргинин, образующий водородные связи с молекулой лиганда. В молекуле ЧСА– это Arg222, в молекуле БСА – Arg198. Эти аргинины расположены«зеркально» относительно Tyr150(149), поэтому для жестких молекул или дляоптически активных соединений можно ожидать различную эффективностьсвязывания в этом сайте. И для ЧСА, и для БСА, продуктивное связывание120ФОС в сайте Tyr150(149) возможно только после каких-то изменений вструктуре альбумина (либо перенос протона с остатка каталитическоготирозина на имидазольное кольцо соседнего гистидина His-242(241), либоконформационные изменения, вызванные связыванием лиганда в другихсайтах).
Согласно полученным нами данным, в стабильных комплексахальбумина с непродуктивно связанным в сайте Tyr150(149) параоксономположение боковых радикалов аминокислот сайта различно для ЧСА и БСА.Это может быть связано с разным распределением зарядов в молекулах этихбелков: суммарный заряд молекулы ЧСА составляет -14e, а БСА -16e. Ранеебыло показано [156], что в сыворотке крови человека остаток одиночного Cys34в 70% молекул альбумина находится в окисленном состоянии. Окислениецистеина также может влиять на распределение зарядов внутри молекулыальбумина, а, значит, на конформацию сайта Tyr150(149) и на эффективностьсвязывания молекул в этом сайте.
Механизм модуляции сайта Tyr150(149)требует дальнейших исследований, т.к. по результатам нашей работы возможнонескольковзаимодополняющихвариантовантидотной терапии отравлений ФОС.повышенияэффективности121Глава 4. ЗаключениеВ токсикологических и фармакологических исследованиях очень важнопонимать специфику видовых различий для адекватной интерпретацииполученных результатов при проведении доклинических и клиническихиспытаний, правильного расчета дозировок для человека. Применительно кизучению фосфорорганических соединений (ФОС), одним из принципиальныхособенностей крови экспериментальных животных - крыс и мышей - являетсяналичие в ней карбоксилэстераз, тогда как в крови человека функциикарбоксилэстераз выполняет альбумин.
Связывая лекарства и токсическиевещества, альбумин в значительной степени определяет их фармако- итоксикокинетику,транспортируяктканям-мишенямилиместамихбиотрансформации. Несмотря на колоссальные возможности современныханалитических методов, имеющиеся данные не позволяют однозначно решитьпроблему наличия или отсутствия у альбумина эстеразной и других типовферментативной активности.
До сих пор механизмы взаимодействия различныхэфиров и других соединений с альбумином остаются нераскрытыми, амежвидовые исследования вообще не проводились. В настоящее времядоступна лишь одна работа, в которой применялись методы молекулярногомоделирования для изучения процесса взаимодействия ФОВ (зомана) сальбумином [121].
При этом докинг проводили только в сайте связыванияTyr411. Метод молекулярной динамики в этой работе не применялся.На основании вышеуказанных проблем были сформулированы цели изадачи настоящего исследования, решение которых могло бы содействовать:(а) разработке и совершенствованию методологии доклиническихиспытаний средств терапии острых отравлений ФОС и другими токсическимсоединенями, транспорт которых осуществляется при участии альбумина;(б) разработке способов направленной модуляции связывающей иэстеразной активности альбумина, а значит повышению эффективностиантидотной терапии.122В результате проведенной работы установлено, что наибольшаяэстеразная активность альбумина, а также условный вклад в ферментативнуюактивность сыворотки наблюдается относительно гидролиза НФА (41%) и ФВ(15%) при сравнении с сывороткой человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
