Диссертация (1145807), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Подтверждение этих предположений может быть получено вэкспериментах in silico.88баРисунок 3.20а. График связыванияРисунок 3.20б. График в координатахзомана с альбумином с отмеченнымиСкетчарда для модели с двумя сайтамиконстантами связывания для моделейсвязывания зомана с альбумином.с одним и двумя сайтами связывания.абРисунок 3.21.
Зависимости Лайнуивера-Берка взаимодействия зомана с БСАпо данным биохимического определения убыли зомана в реакционной смеси.Диапазон концентраций зомана 16,48 ÷ 0,28 мкМ.3.5.Поисксайтов,ответственныхзаэстеразнуюактивностьальбумина, методами молекулярного моделирования.До сих пор остается невыясненным вопрос, какие именно аминокислотыальбумина отвечают за эстеразную и псевдоэстеразную активность. Методоммасс-спектрометрии были определены 82 а.о. альбумина, которые могут бытьацетилированы п-нитрофенилацетатом: 59 лизинов, 10 серинов, 8 треонинов, 4тирозина и 1 аспартат [126]. Авторы исследования показали, что максимально89эффективно молекула НФА связывается с Tyr411.
Высокая реактивность этойаминокислоты обусловлена пространственной близостью остатка Arg410,который ослабляет связь О-Н тирозина и тем самым повышает егонуклефильную активность. Отмечена высокая консервативность Tyr411 иArg410вальбуминахмлекопитающих,чтосвидетельствуетобихвзаимодействии и взаимовлиянии [38]. Ранние масс-спектрометрическиеисследования показали, что остаток Tyr411 является сайтом связывания длятаких фосфорорганических эфиров как зоман, зарин, циклозарин и табун [147].Однако не исключается возможность существования дополнительных сайтоввзаимодействия альбумина с ФОС [197], так как с помощью массспектрометрическихметодовможноустановитьлишьотносительнодолгоживущие ковалентные аддукты, и оценить данные методы могут толькопсевдоэстеразнуюактивностьбелка.Истинныефермент-субстратныекомплексы быстро распадаются в ходе ферментативной реакции и неподдаются детектированию методами масс-спектрометрии.Одна из задач данной работы - выявить возможные сайты взаимодействияальбумина с зоманом и оценить возможность ферментативной реакции в этихсайтах.
Для этого методами молекулярного моделирования было исследованосвязывание альбумина с зоманом. Зоман был выбран для расчетныхэкспериментов по двум причинам. Одна из них имеет главным образомприкладной характер и связана с тем, что сывороточный альбумин человекаможет выступать в качестве основного белка крови, неспецифическисвязывающегоигидролизующегонекоторыеФОС,вчастностивысокотоксичный зоман, в отличие, например, от грызунов, у которыхактивным участником токсикокинетики зомана является карбоксилэстеразаплазмыкрови[30].Другаяпричина-значительноеколичествоэкспериментальных данных о взаимодействии альбумина и других эстераз соптическими изомерами зомана, что позволило использовать зоман в качествемодельногосоединениядляизучения(псевдо)эстеразнойактивностиальбумина.
В частности, было установлено, что фосфонилирование альбумина90зоманом в сайте Tyr411 идет очень медленно (константа скорости 15 М-1мин-1),спонтанная реактивация (фосфотриэстеразная активность альбумина) такжепроисходит чрезвычайно медленно (0.0044 ч-1), так что образующийся аддуктдовольно стабилен (t1/2 = 6,5 сут). Однако по количеству образуемого в ходевзаимодействиязначительнаясзоманомдополнительнаяфторид-ионабылагидролитическаяобнаруженаактивностьдовольноальбумина,объяснение которой не найдено и количественный вклад которой не оценендолжным образом. Это позволяет сделать предположение, что Tyr411обусловливает псевдоэстеразную активность альбумина по отношению кзоману, в то время как истинно ферментативный гидролиз зомана происходит вдругом сайте или сайтах альбумина.
На эту роль может претендовать Tyr150,так как масс-спектрометрическими методами был обнаружен аддукт сальбумином по Tyr150 другого высокотоксичного ФОС - вещества типа VX[158]. Кроме того, установлено, что Tyr411 образует устойчивые ковалентныеаддукты преимущественно с агентами G-типа (зарин, зоман) и наоборот, Tyr150- с агентами V-типа [103]. На основании этих данных аминокислотные остаткиTyr411 и Tyr150 были выбраны в качестве основных для исследованиявзаимодействия альбумина с зоманом методами молекулярного моделирования.Известно,чтодляпродуктивногосвязываниямолекулсубстратовинеобратимых ингибиторов в активном центре холинэстераз необходимаактивация аминокислот каталитической триады, в ходе которой происходитпереход протона с гидроксила серина на имидазольное кольцо каталитическогогистидина [4]. Мы предположили, что аналогичный перенос протонанеобходим и при связывании зомана с альбумином.
Поэтому для процедурымолекулярногодокингамыиспользовалидвасостоянияпроцессапротонирования остатков тирозина по положениям 150 и 411: протонированное(1, неактивированное) и депротонированное (2, активированное). При анализеближайшего окружения аминокислотных остатков Tyr411 и Tyr150 быливыбраны аминокислотные остатки Lys414 и His242, соответственно, в качествеакцепторов протонов от этих остатков тирозина. Был проведен молекулярный91докинг изомеров зомана в эти сайты при различном состоянии протонированиятирозинов,стабильностьмолекулярнойполученныхдинамики.Нижекомплексовпредставленыпроверенарезультатыметодомпоискаальтернативных сайтов взаимодействия альбумина с зоманом, выдвинутопредположение о существовании сайтов, которые могут быть ответственны заэстеразную активность альбумина.Связывание зомана в сайтах Tyr411 и Tyr150 альбумина человека.
Зоманпредставляет собой смесь четырех стереоизомеров. Молекула зомана имеет двахиральных центра: атом углерода и атом фосфора. Пары энантиомеров зомана(С(+)Р(+) и С(-)Р(-); С(+)Р(-) и С(-)Р(+)) представлены в синтетическомС(±)Р(±) зомане в соотношении 45:55, с эквивалентным количеством двухэнантиомеров внутри каждой пары [30].
В последнее время применяют новыеобозначенияконфигурацийстереоизомеров.Так,старыеобозначениярасположений заместителей относительно хиральных центров Р-, Р+, С+ и Ссоответствуют новым обозначениям PS, PR, CS и CR соответственно.Для выявления особенностей механизма связывания ФОС в активныхцентрах альбумина, был проведен молекулярный докинг четырех изомеровзомана в следующие сайты ЧСА: сайт Tyr411 альбумина в неактивированном состоянии аминокислот сайта(протонированный Tyr411, депротонированный Lys414) сайт Tyr411 альбумина в активированном состоянии аминокислот сайта(депротонированный Tyr411, протонированный Lys414). сайт Tyr150 альбумина в неактивированном состоянии аминокислот сайта(протонированный Tyr150, единожды протонированный His242) сайт Tyr150 альбумина в активированном состоянии аминокислот сайта(депротонированный Tyr150, дважды протонированный His242)По результатам молекулярного докинга были рассчитаны Kd альбуминазоманом (Табл.
3.15). С помощью методов молекулярной динамики былапроведена оценка продуктивности всех полученныхкомплексов.методом докинга92Таблица 3.15.Оценка связывания зомана с двумя тирозиновыми остатками ЧСАСайтСтереоизомеры зоманаХарактеристикисвязывания иP(-)C(-) P(+)C(-) P(-)C(+) P(+)C(+)связыванияего состояниеKd (µM)578,1593,9718,9859,1Геометриянетнетнетнет(на одной прямой?)411Расстояние O-PНеактивирован0,720,730,680,68(нм)оценканетнетнетнетпродуктивностиKd (µM)439,5483,7403,7684,6геометриянетданетда(на одной прямой?)411Расстояние O-PАктивирован0,370,370,370,36(нм)оценканетданетдапродуктивностиKd (µM)264,1451,0183,5431,9Геометриядададада(на одной прямой?)150Расстояние O-PНеактивирован0,360,330,340,34(нм)оценкададададапродуктивностиKd (µM)277,6439,4195,2431,7Геометриядададада(на одной прямой?)150Расстояние O-PАктивирован0,340,330,340,34(нм)оценкададададапродуктивностиДокинг зомана в сайт Tyr411 альбумина.
Молекулярный докинг зомана всайт Tyr411 в неактивированном (протонированном) состоянии впервые былпроведен в 2008 г. [121]. Согласно полученным данным, расстояние междуатомом фосфора зомана и гидроксильным кислородом тирозина варьироваломежду 0.68 и 0.72 нм, значения констант диссоциации составляли от 115 до 226мкM. P(+)- и P(-)-стереоизомеры лиганда сорбировались с одинаковой93эффективностью, C(+)-энантиомер взаимодействовал с сайтом слабее, чем C(-)изомер. Наш анализ комплексов зомана в сайте Tyr411 при протонированииостатка тирозина показал, что значение dist(O-P) составляет 0.68 нм для C(+)изомеров, 0.72 и 0.73 нм для P(-)C(-) и P(+)C(-)-изомеров, соответственно (рис.3.22a).
В работе Li et al. [121] были получены те же значения, но дляпротивоположных изомеров, т.е. 0,68 нм для С(-) и 0,75 нм для С(+)стереоизомеров. Считается, что атака гидроксила серина холинэстераз накарбонильный атом углерода лиганда возможна при расстоянии между нимименьшем, чем 4 ангстрема [208]. Согласно этому критерию, полученные намизначения dist(O-P) слишком велики для нуклеофильной атаки Tyr411 атомафосфора зомана, и образование новой ковалентной связи между зоманом итирозином невозможно. Значения Kd варьируют между 578 и 859 мкM.Стереохимия атома фосфора в рассматриваемых комплексах не влияет назначение Kd, однако C(+) и C(-)-стереоизомеры взаимодействуют с сайтомTyr411 с разной эффективностью.
Эти данные в целом совпадают срезультатами работы Li et al. [121], но отличаются в большую сторону повеличине в 3-4 раза. Различия в значениях Kd можно объяснить тем, что внашейработепередпроцедуройдокингамолекулаальбуминабыламинимизирована, что привело к изменению конформации сайтов связывания. Вкомплексах зомана в сайте Tyr411 при депротонировании остатка тирозина всестереоизомеры связываются с гидроксилом тирозина в одном и том жеположении относительно тирозина, значение dist(P-O) составляет 0.36 нм дляP(+)C(+)-изомера и 0.37 нм для трех остальных изомеров (рис. 3.22б). В такомположении возможна атака гидроксилом тирозина атома фосфора зомана.
Всеизомеры связываются с одинаковой эффективностью,поскольку значениеконстант диссоциации варьирует от 404 до 484 мкM. Исключение составляетP(+)C(+)-изомер, для которого Kd = 685 мкM.Геометрия ни одного из комплексов не удовлетворяет параметрампродуктивности: в таких конформациях невозможна атака гидроксила тирозинана атом фосфора. Анализ данных докинга зомана в активированный сайт94Tyr411, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
