Диссертация (1145807), страница 11
Текст из файла (страница 11)
в 7 разменьше.3.2.Сравнительноеисследованиесвязывающейиэстеразнойактивности альбумина человека, быка и крысы с НФА в качествесубстрата.В экспериментах использовали три вида альбумина – человеческий,бычий и крысиный сывороточные альбумины, свободные от жирных кислот –59ЧСA, БСA, КСA. В качестве субстратов для определения и эстеразнойактивности был использован НФА. Принцип метода основан на определенииконцентрации образовавшегося в результате ферментативного гидролизанитрофенола.ИзмеренияпроводилинапланшетномспектрофотометреMultiskan Ascent при длине волны 405 нм в кинетическом режиме.
При работе сНФА в качестве субстрата концентрация альбумина не превышала 1 мг/мл (15мкМ). Раствор альбумина готовили на ФБ 0,02 М рН 7,3-7,5. Маточный растворНФА готовили на этиловом спирте с дальнейшим разведением рабочихконцентраций в ФБ. Исследование влияния ингибиторов и фармакологическихпрепаратов на активность эстеразной активности альбумина проводили врежиме предварительной инкубации исследуемого препарата в раствореальбумина в течение 30 минут при t = 25°С в соотношении 1:100.
Вконтрольной пробе содержался ФБ. В лунку планшета вносили 270 мклисследуемого раствора альбумина (холостая проба 270 мкл ФБ). Реакциюзапускали добавлением 30 мкл НФА.Математические модели кинетики сайтов Садлоу I и II. Для анализамеханизма реакции, катализируемой альбумином, и количественной оценки еёкинетическихпараметровмыприменялимодельрасщепленияНФАальбумином, предложенная Ascenzi и соавт. [19], ацилферментативную модельрасщепления НФА химотрипсином, предложенную Бендером и соавт. [29],модель гидролиза НФА липазой [58], модель ингибирования холинэстеразфосфорорганическими соединениями [128].На первом этапе взаимодействия альбумина с субстратом (схема 1)происходит его адсорбция в сайте Садлоу II (ES), быстрое высвобождениепродукта п-нитрофенола (P1), отмечаемое как «всплеск» активности, инеобратимое ацетилирование аминокислотного остатка Tyr411 (EA).
На второмэтапе субстрат связывается с альбумином в сайте Садлоу I, где происходит егогидролиз до ацила (P2) и п-нитрофенола (P1).60(1)Схема 1. Взаимодействие между альбумином и субстратом (пнитрофенилацетатом или параоксоном). S – субстрат, P1 – п-нитрофенол, P2 –ацильная группа.Предстационарное состояние (кинетика Садлоу II). Амплитуду фазы«всплеска», на которой происходит крайне быстрая реакция в сайте Садлоу IIмежду Tyr411 и НФА, обозначим α.
Константой скорости данной реакцииявляется kobs. Выход продукта представляет собой реакцию (псевдо)первогопорядкавтечениепочти95% временифазы«всплеска».Скоростьдеацетилирования сайта Садлоу II k3 по меньшей мере в 100 раз ниже скоростиацетилирования тирозина, полученной даже на самых низких концентрацияхсубстрата.Использованные нами аппроксимирующие функции имеют вид:(2)где:(3)(4)Преобразуем уравнение 4 по методу двойных обратных величин. Скоростьдеацетилирования сайта Садлоу II очень низка, поэтому константой k3 можнопренебречь:(5)Стационарное состояние (кинетика Садлоу I) описывается следующимуравнением:(6)61Уравнения 5 и 6 имеют формуи могут быть использованы длялинейного регрессионного анализа.
Определив наклон прямой и её пересечениес осью ординат, мы найдём k2, k3, Ks и.Данные предварительно обрабатывали в Microsoft Excel. Нелинейную илинейнуюаппроксимациюфункций(методомнаименьшихквадратов),статистическую обработку данных и визуализацию результатов выполняли спомощью языка программирования Python (http://www.python.org) в средеJupyter с установленным ядром IPython. Использовали следующие сторонниепакеты из научного стека: NumPy, Scipy, Matplotlib, Seaborn, Pandas и LmFit[94, 139, 153, 155, 188].
Данные приводятся в виде(стандартнаяошибка). Планки погрешностей на рисунках соответствуют значениямстандартной ошибки.Исследование эстеразной активности разных видов альбумина in vitro.Для изучения эстеразной активности альбумина мы провели несколько серийэкспериментов. Альбумин инкубировали in vitro с НФА в различныхконцентрациях.используемымНФАприявляетсяизученииклассическимэстеразноймодельнымактивностисоединением,ферментов.Прирасщеплении НФА образуется п-нитрофенол, который в ионизированной формеимеет пик абсорбции при длине волны 405 нм (ε = 18,1 мМ-1 см-1).
Ацетильнаягруппа может оставаться связанной с молекулой фермента (в виде ковалентногоаддукта; «псевдоэстеразная активность») или отщепляться (истинно эстеразнаяактивность). При проведении экспериментов учитывали спонтанный гидролизНФА. В процессе обработки результатов вводили поправку, а уже затемпроводиликинетическийанализсобственноферментативныхреакций.Описанный математический алгоритм позволил установить ряд кинетическихконстант.Во всех экспериментах регистрировался «всплеск» ферментативнойактивности альбумина в первые 60 с инкубирования (предстационарноесостояние), после чего реакция выходила на плато (стационарное состояние).Резкий «всплеск» концентрации нитрофенола на ранней стадии инкубирования62объясняется, по-видимому, реакцией субстрата с остатком Tyr411 (у бычьегосывороточного альбумина этот остаток имеет номер 410) в сайте Садлоу II, врезультате которой Tyr411 необратимо ацетилируется и уже не способенвступать в реакцию с субстратами.
Плато представляет собой медленную«истинную» эстеразную реакцию, катализируемую в сайте Садлоу I.Сайт Садлоу I. Сайт Садлоу I ЧСА образован всеми 6 α-спиралямисубдомена IIA и фрагментом «поворот-спираль» субдомена IB (остатки 148154). Сайт состоит из центральной зоны, связанной с тремя отдельнымиполостями (одна из которых соответствует сайту связывания жирных кислотFA7).
Внутренняя часть сайта преимущественно неполярна, однако содержитдва полярных участка: один — у основания сайта (Tyr150, His242, Arg257), адругой — у входа в него (Lys195, Lys199, Arg218, Arg222).Сайт Садлоу II. Согласно данным кристаллографического анализа, сайтСадлоуIIЧСАпредставляетсобойбольшойнеполярный«карман»(соответствует сайтам связывания жирных кислот FA3 и FA4) с единственнымполярным участком, который образован остатками Tyr411 и Arg410 ирасположен у самого входа в сайт. Реакция между НФА и остатком Tyr411происходит по механизму нуклеофильного замещения: атом кислородагидроксильной группы Tyr411 совершает нуклеофильную атаку на атомуглерода ацетильной группы НФА, а атом кислорода НФА – на атом водородагидроксильной группы тирозина.
В результате этой реакции образуетсяковалентная связь между атомом кислорода боковой цепи тирозина иацетильной группой. Остаток Tyr411 ацетилируется практически необратимо[126], а для расщепления образовавшейся эфирной связи необходимоизменение pH среды и добавление сильного нуклеофильного агента.БиохимическиеисследованияхарактеравзаимодействияНФАсальбумином. Проведены эксперименты по гидролизу НФА альбумином сприменением специфических лигандов сайтов Tyr150 (варфарин) и Tyr411(ибупрофен, НФФ).
При использовании НФА в качестве субстрата внасыщающих концентрациях (200 и 600 мкМ), в течение первой минуты63происходит"всплеск"активности,послечегосистемапереходитвстационарный режим (рис. 3.4). Такой характер реакции альбумина с НФА былописан еще в 1972г. [186]. Авторы этой работы предположили, что этот"всплеск"обусловленпсевдоэстеразнойактивностьюальбумина,сопровождающейся ацетилированием одного остатка тирозина, тогда какстационарный режим функционирования свидетельствует о наличии уальбумина второго сайта с "истинно" эстеразной активностью.Рисунок 3.4а. Начальная стадия гидролиза НФА (200мкМ) альбуминомчеловека (15 мкМ) с применением специфических лигандов.Рисунок 3.4б. Начальная стадия гидролиза НФА (600мкМ) альбуминомчеловека (15 мкМ) с применением специфических лигандов.64Мы провели кинетический анализ начальных скоростей именно этойстадии "всплеска" активности альбумина.
Такой анализ именно этой стадиибыл впервые описан в работе Zaidi et al. в 2013 г. [205].Построенная нами математическая модель и полученные с ее помощьюрезультаты позволили определить следующие кинетические и равновесныеконстанты: 1) константа связывания субстрата для сайта Садлоу II, Ks; 2)константа скорости ацетилирования сайта Садлоу II и образования продукта (пнитрофенола), k2; 3) бимолекулярная константа ингибирования сайта Садлоу II,ki [128]; 3) константа скорости реактивации (число оборотов) сайта Садлоу I, k3;4) кажущаяся константа Михаэлиса для сайта Садлоу I, Kmapp.Как следует из данных, приведенных в таблице 3.5 и на рисунке 3.5а, сайтСадлоу Iкрысиногоальбуминаобладаетнаибольшейкаталитическойэффективностью по отношению к НФА, которая примерно в 2 раза выше посравнению с альбумином человека и в 5,5 раз выше каталитическойэффективности бычьего альбумина.
Эти различия обусловлены исключительнонеодинаковым сродством сайта Садлоу I исследуемых альбуминов к субстрату,т.к. число оборотов у них одинаково. Различия в константах ингибированияКСA и ЧСA в сайте Садлоу II незначительны (рис. 3.5б), тогда как этотпоказатель у бычьего альбумина более чем в 2 раза выше, что такжеобусловлено более высоким сродством сайта Садлоу II БСA к субстрату.Такимобразом,сиспользованиемНФАвкачествесубстратаустановлено, что равновесные и кинетические характеристики обоих сайтовСадлоу человеческого и крысиного сывороточного альбумина отличаютсямежду собой в меньшей степени по сравнению с характеристиками этих сайтовбычьего альбумина, причем характеристики Садлоу II ЧСA и КСA практическиодинаковы. Последнее обстоятельство подтверждает предположение обэволюционной консервативности сайта Садлоу II по сравнению с сайтомСадлоу I исследованных видов альбумина.65Таблица 3.5.Характеристики карбоксилэстеразной активности разных видов альбуминаЧСАБСAКСAСадлоу II Предстационарный режим-1k2 (с )0.48 ± 0.10.48 ± 0.010.47 ± 0.01Ks = k-1/k1 (мкМ)5.92 ± 0.992.77 ± 1.16.28 ± 0.67-1-1k2/Ks (мM × c )81.1 ± 7.7173.3 ± 21.174.8 ± 4.45Садлоу I Стационарный режим-1k3 (с )0.020 ± 0.0010.020 ± 0.0030.019 ± 0.003Kmapp (мкМ)761.9 ± 50.52208.3 ± 73.8396.7 ± 95.1app-1-1k3/Km (мM × c )0.026 ± 0.0010.009 ± 0.0010.051 ± 0.008Рисунок 3.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
