Диссертация (1145807), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В отличиеот ибупрофена, варфарин не ингибировал сайт Садлоу II (табл. 3.9).Такимобразом,ингибиторныйанализобоихсайтовСадлоусиспользованием НФА в качестве субстрата позволил получить дополнительныесвидетельства того, что функциональные характеристики человеческого икрысиного сывороточного альбумина отличаются между собой в меньшейстепени по сравнению с функциональными характеристиками бычьегоальбумина. Кроме того, дополнительно подтверждается предположение обэволюционной консервативности сайта Садлоу II по сравнению с сайтомСадлоу I.3.3.Сравнительноеисследованиесвязывающейиэстеразнойактивности альбуминов человека, быка и крысы с параоксономвкачестве субстрата.Параоксон — это диэтил-п-нитрофенилфосфат, соединение, структурносхожее с п-нитрофенилацетатом.
Параоксон отличает сравнительно высокаястабильность и низкая скорость спонтанного гидролиза. В ходе обработкирезультатовмывычиталиспонтанныйгидролизизсобственноферментативного. Ферментативное расщепление параоксона, катализируемоеальбумином, приводит к образованию п-нитрофенола и диэтилфосфата,который может образовывать ковалентную связь с остатком Tyr411 сайта75Садлоу II ЧСА или попадать в среду в деацилирования Tyr411 илиферментативного гидролиза в Садлоу I.При работе с использованием параоксона в качестве субстрата растворальбумина 25мг/мл готовили на 0,1М трис-буфере, рН 8,0.
Маточный растворпараоксона готовили на ацетонитриле с последующим разведением рабочихконцентраций в трис-буфере. Пробы альбумина с исследуемыми образцамитакже проводили в режиме предварительной инкубации в течение 30 мин приt=25°С в соотношении 1:100.
В лунку 96-луночного планшета вносили 225 мклальбумина, в качестве холостой пробы - трис-буфер. Устанавливали на приборережим считывания и запускали реакцию добавлением 25 мкл растворапараоксона. Полученные результаты переводили в программу Microsoft Excel ирасcчитывали кинетику в микромолях образовавшегося нитрофенола, завычетом холостых проб.Сайт Садлоу I. Сравнение ферментативной активности разных видовальбумина в отношении НФА и параоксона показало, что сайт Садлоу I ЧСАобладает примерно таким же сродством, но его параоксоназная каталитическаяэффективность k3/Kmapp в 65 раз ниже эстеразной в отношении НФА, т.е.исключительно за счет меньшего числа оборотов (k3).
Сайт Садлоу I БСАобладает в 5 раз большим сродством к параоксону, но его параоксоназнаякаталитическая эффективность k3/Kmapp в 4 раза ниже эстеразной в отношенииНФА, т.к. число оборотов в 20 раз ниже. Сайт Садлоу I КСA обладаетсродством к параоксону примерно в 3,5 раз ниже по сравнению с НФА, а егопараоксоназная каталитическая эффективность k3/Kmapp на 2 порядка ниже, т.к.число оборотов примерно в 30 раз ниже.Таким образом, по отношению к параоксону наибольшей каталитическойэффективностью из трех видов альбумина обладает БСA, который в 4,1 и 5,3раза активнее по показателю k3/Kmapp, чем КСA и ЧСA, соответственно (рис.3.12а, табл. 3.10).
Функциональные характеристики сайта Садлоу I крысиного ичеловеческого альбумина ближе между собой, что мы наблюдали также и сНФА в качестве субстрата.76Сайт Садлоу II. Как и в случае с НФА, сайт Садлоу II имеет болеевысокое сродство к параоксону по сравнению с Садлоу I: его равновеснаяконстанта ниже установленной для Садлоу I в 200, 500 и 560 раз для ЧСA, БСAи КСA, соответственно (рис.
3.12б, табл. 3.10). При этом аффинность Садлоу IIвсех трех видов альбумина к параоксону выше аффинности к НФА примерно в1,5, 2,5 и 3 раза для ЧСA, КСA и БСA, соответственно. Константа скоростифосфорилирования k2 практически не отличается от таковой константы вреакции ацетилирования с НФА в качестве субстрата. Расчет бимолекулярнойконстанты ингибирования даёт основания заключить, что сайт Садлоу II БСAсущественно быстрее образует ковалентные связи с диэтилфосфатнымостатком по сравнению с ЧСA и КСA (примерно в 5 и 3 раза), формируяковалентные аддукты, которые, по литературным данным, имеют T1/2 не менее7 суток [87].
Другой важный вывод состоит в том, что фосфорилирование сайтаСадлоу II всех трех видов альбумина при взаимодействии с параоксономпроисходит быстрее ацетилирования этих сайтов, хотя для ЧСA эта разницанесущественна.Таблица 3.10.Кинетические характеристики параоксоназной активности разных видовальбумина в отношении параоксонаЧСAБСAКСAСадлоу II Предстационарный режим-1k2 (с )0.43 ± 0.010.49 ± 0.020.48 ± 0.01Ks =k -1 /k 1 (мкМ)3.99 ± 1.72.41 ± 0.80.86 ± 0.1-1-1k2/Ks (мM × c )0.15 ± 0,060.58 ± 0,060.23 ± 0,08-6 -1k3 (×10 с )0.82 ± 0.150.75 ± 0.210.50 ± 0.25Садлоу I Стационарный режим-1k3 (с )0.00032 ± 0.00001 0.00096 ± 0.000060.00072 ± 0.00007appKm (мкМ)801.6 ± 7.81361.6 ± 165.3447.7 ± 34.5app-1 -1k3/Km (мМ с ) 0.00040 ± 0.00001 0.00216 ± 0.000290.00052 ± 0.0000277Рисунок 3.12.
(а) Зависимость начальной скорости V0 параоксоназной реакции,катализируемой альбумином в сайте Садлоу I, от концентрации субстрата [S0],в координатах Лайнуивера-Берка. (б) Зависимость константы скорости первогопорядка kobs предстационарного состояния от начальной концентрациисубстрата [S0] в двойных обратных координатах (для сайта Садлоу II).Исследование действия ибупрофена и варфарина на параоксоназнуюактивность различных видов альбуминаИбупрофен. Эстеразную активность альбумина по параоксону определялив минутном режиме в диапазоне от 5 до 270 мин. Начальный периодрегистрировали в диапазоне от 0 до 30 мин с 5-минутным интервалом.Дальнейшую кинетику регистрировали от 30 до 270 мин с 30-минутныминтервалом. Концентрация альбумина во всех экспериментах составляла 25мг/мл (375 мкМ).
Концентрация параоксона – от 1,5 до 12 мМ. Ибупрофениспользовали в концентрациях 200-800 мкМ. Скорость гидролиза параоксонапри действии ибупрофена снижается как в начальный период (30мин), так и втечение всего периода наблюдения (рис. 3.13, табл. 4.1), т.е. ибупрофенподавляет обе фазы (псевдо)эстеразной активности альбумина.В экспериментах с параоксоном ибупрофен ингибировал параоксоназнуюреакцию в сайте Садлоу I.
Поскольку ибупрофен не способен напрямуювзаимодействовать с сайтом Садлоу I [17], мы предполагаем, что он выступаетв роли аллостерического регулятора, способного менять конформациюальбумина и тем самым изменять его активность. Это предположение имеет78под собой логическое и экспериментальное обоснование [201]. В результатеобработкиэкспериментальныхданныхматематическими(нелинейныйрегрессионный анализ с применением модели оценки ингибирующего влияниясоединения на ферментативную реакцию) и графическими методами (методЛайнуивера-Берка, Корниш-Боудена и Диксона) определен неконкурентныйтип ингибирования ибупрофеном реакции расщепления параоксона в сайтеСадлоу I (рис.
3.14 и 3.15). Ингибирующего влияния ибупрофена напараоксоназную реакцию в сайте Садлоу II выявлено не было. Очевидно,главной причиной этого феномена является более высокое сродство параоксонак сайту Садлоу II (Ks параоксона ниже примерно на 2 порядка Ki ибупрофена сНФА в качестве субстрата).Таблица 3.11.Влияние ибупрофена на скорость гидролиза параоксонаИбупрофен, мкМРOX,мМ02004006008005-30 мин; V, мкмоль/мин1,50,01870,01130,00740,00540,003930,02970,01810,01080,00750,006560,04350,02350,01280,00810,007190,05430,02880,01310,00610,004060-210 мин; V, мкмоль/мин1,50,02380,0018-0,0011-0,00590,001530,03730,01270,00660,00770,006160,05130,01990,00790,00480,004690,06460,02230,00920,0022-0,00907950,00С, мкМ40,0030,00ИП 0 pOX 1,520,00ИП 0 pOX 310,00ИП 0 pOX 6ИП 0 pOX 120,0001000020000Сек.40,00С, мкМ30,00ИП 200 pOX 1,520,00ИП 200 pOX 3ИП 200 pOX 610,00ИП 200 pOX 120,0001000020000Сек.С, мкМ40,0030,00ИП 400 pOX 1,5ИП 400 pOX 320,00ИП 400 pOX 610,00ИП 400 pOX 120,0001000020000Сек.С, мкМ40,0030,00ИП 600 pOX 1,520,00ИП 600 pOX 3ИП 600 pOX 610,00ИП 600 pOX 120,00010000Сек.20000С, мкМ40,0030,00ИП 800 pOX 1,520,00ИП 800 pOX 3ИП 800 pOX 610,00ИП 800 pOX 120,0001000020000Сек.Рисунок 3.13.
Кинетика гидролиза параоксона (pOX) при взаимодействии БСАс ибупрофеном (ИП)80Рисунок 3.14. Неконкурентное ингибирование ибупрофеном параоксоназнойактивности сайта Садлоу I крысиного альбумина (RSA): по Диксону (а), поКорниш-Боудену (б). Концентрация альбумина [E0] во всех вариантахсоставляла 375 мкМ. Концентрации ингибитора – 200, 400 и 800 мкМ.Рисунок 3.15. Неконкурентное ингибирование ибупрофеном параоксоназнойактивности сайта Садлоу I человеческого альбумина (HSA): по Диксону (а), поКорниш-Боудену (б).
Концентрация альбумина [E0] во всех вариантахсоставляла 375 мкМ. Концентрации ингибитора – 200 и 400 мкМ.Варфарин. При исследовании действия варфарина на (псевдо)эстеразнуюактивность альбумина использовали такие же концентрации белка и субстратакак в экспериментах с ибупрофеном. Варфарин использовали в концентрациях100, 200, 400, 600 мкМ. Временной диапазон наблюдения от 0 до 270 мин(16200 сек).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
