Диссертация (1145807), страница 14
Текст из файла (страница 14)
На рис.3.16 и в табл.3.12 представлены данные по кинетикегидролиза параоксона альбумином при взаимодействии с варфарином во всемвременном интервале наблюдения.81Рисунок 3.16. Влияние варфарина на кинетику гидролиза параоксонаПолученные данные свидетельствуют об отсутствии влияния варфаринана "вторую начальную скорость" - стационарную фазу гидролиза параоксона,но в то же время незначительно и нелинейно (т.е. примерно в одинаковойстепени все концентрации варфарина) подавлят "первую начальную скорость" фазу всплеска гидролитической активности.Таблица 3.12.Влияние варфарина на кинетику гидролиза параоксонаpOX мМВарфарин, мкМ01002004006005-30 мин.
V, мкмоль/мин1,50,02080,02080,02140,01990,034730,10410,03620,03270,02680,031060,10790,03990,03190,04000,040690,10750,01480,00430,01940,012960-210 мин. V, мкмоль/мин1,50,01770,01940,01800,01790,016530,03220,03280,03310,03300,034560,03850,03900,04000,04000,041490,03710,04040,04120,04160,042782Удивительно то, что варфарин не оказывал ингибирующего влияния наактивность обоих сайтов, в первую очередь сайта Садлоу I всех трех видовальбумина по отношению к параоксону (Табл.3.13). Причин, причем невзаимоисключающих, может быть несколько. Данные докинга (см.
раздел 3.5)свидетельствуют об относительно слабой специфичности варфарина поотношению к сайту Садлоу I, и при сверхнасыщающих концентрацияхпараоксонав нашихэкспериментахварфаринне может эффективноконкурировать с ним. Другая причина - высокая аффинность параоксона ксайтуСадлоуIнауровнесубстратнойконстантыпервогоэтапавзаимодействия, согласно схеме 1 (раздел 3.2).
Высокая величина кажущейсяKm (табл.3.10) не отражает первичную аффинность, т.к. она получена с учетомскоростей прямой и обратной реакций второго этапа взаимодействия, а такжечисла оборотов условно ферментативной реакции в сайте Садлоу I. Кроме того,параоксон и варфарин могут быть по-разному пространственно ориентированыв сайте Садлоу I.
Наконец, можно предположить, что медленный катализпараоксона осуществляется в неком третьем сайте, «неподконтрольном»варфарину. Наименее вероятным нам представляется предположение о том, чтособственнокаталитическая(параоксоназная)активностьальбуминаобусловлена спонтанной реактивацией сайта Садлоу II, т.к. число оборотов k3Садлоу II на 3 порядка меньше чем k3 Садлоу I (табл. 3.10). Для адекватнойинтерпретацииэтогофактатребуетсяпроведениедополнительныхэкспериментов in vitro и in silico с применением альтернативных ингибиторов иметодовмолекулярногосравнительногомоделирования.биохимическогоанализаТакимтрехобразом,видовданныеальбуминасиспользованием НФА и параоксона в качестве субстратов свидетельствуют отом, что равновесные и кинетические характеристики обоих сайтов Садлоучеловеческого и крысиного сывороточного альбумина довольно близки междусобой, но существенно отличаются от аналогичных характеристик бычьегоальбумина.
Карбоксилэстеразные характеристики сайта Садлоу II ЧСA и КСAпрактически одинаковы, тогда как параоксоназные характеристики лишь83незначительно отличаются между ЧСA и КСA. Ингибиторный анализ обоихсайтов Садлоу с использованием НФА и параоксона в качестве субстрата такжесвидетельствует о том, что функциональные характеристики ЧСА и КСАотличаются между собой в меньшей степени по сравнению с функциональнымихарактеристикамипредположение,БСА.основанноеРезультатынаданныхисследованийобуровнеподтверждаютаминокислотнойидентичности сайтов, об эволюционной консервативности сайта Садлоу II посравнению с сайтом Садлоу I исследованных видов альбумина.
Кроме того,полученные результаты дают основания предполагать, что БСА в целом болееконсервативен по отношению к ЧСА и особенно к КСА.Таблица 3.13.Кинетические характеристики ингибирующего влияния ибупрофена иварфарина на сайт Садлоу I различных видов альбумина при использованиипараоксона в качестве субстратаИнгибитор / Ki, мкМЧСAКСAБСAСадлоу I Стационарный режимИбупрофен:250,2 ± 19,9686,9 ± 74,3300,4 ± 12,4Варфарин———Ki – константа диссоциации ингибитора, мкМ.3.4. Исследование связывающей и эстеразной активности альбуминас зоманом в качестве субстрата.Исследование ингибирования НФА-активности альбумина зоманом. Вкачестве исследуемого образца был выбран альбумин человека (ЧСА) вконечной концентрации 1 мг/мл (15мкМ). Зоман был взят в избытке, 0,75мг/мл(412мкМ).
Измерение активности по НФА проводили на временных точках 0,15, 30, 45, 60, 100, 150, 1300, 1380, 1440 минут на планшетномспектрофотометре. В лунку вносили 130 мкл буферного раствора, 20 мклисследуемой пробы и 50 мкл разведенного в 10 раз в буферном растворесубстрата. Субстрат предварительно растворяли в этаноле.
Измеренияпроводили на длине волны 405нм в кинетическом режиме (каждые 15 сек) для84проверки линейности накопления продукта. Видно, что даже при избыткезомана по отношению к альбумину, его НФА-активность ингибируется неболее чем на 40% (Рисунок 3.17). Максимум ингибирования наступаетпримерно через 120 мин и при дальнейшем инкубировании не изменяется. Этосвидетельствует о том, что гидролиз НФА происходит не в одном сайте ЧСА.баРисунок 3.17. Ингибирование НФА-активности альбумина (75мкМ) зоманом(82-412мкМ) (а) и НФФ (350 мкМ) (б).Определениеколичествасвязавшегосясальбуминомзоманапоостаточному ингибированию АХЭ зоманом.
Влияние преинкубации зомана сальбумином исследовали по остаточному ингибированию АХЭ зоманом.Калибровку по зоману делали в диапазоне концентраций 1х10 -8 – 1х10-7 М(рис.3.18). Всего было 3 типа проб: 1) зоман + буфер = контрольсамопроизвольного распада зомана; 2) буфер + белок = контроль влияния белкана активность АХЭ; 3) зоман + белок = опытная проба.Конечныеконцентрации: 2х10-4мг/мл (1,1мкМ) для зомана и 10мг/мл (145,6мкМ) дляЧСА, т.е. зоман использовали в ненасыщающих концентрациях. Инкубировалипри 37°С, через промежутки времени 30, 60, 120, 240 минут отбирали по100мкл пробы, разводили в 2000 раз.
Полученные образцы анализировали пометоду Эллмана. Процент ингибирования/активности в пробе без белкаоценивали относительно «чистого» контроля АХЭ. Опытные пробы оценивалиотносительно «грязного» контроля АХЭ (проба 2) (рис.3.19).85Рисунок 3.18. Калибровка по зоману в диапазоне концентраций 1×10-8–1×10-7 МРисунок 3.19. Динамика изменения % ингибирования АХЭ послеинкубирования зомана с ЧСА и с буфером.По калибровке оценивали остаточную концентрацию зомана (табл.3.14).Учитывая, что в растворе находилось 145,6 мкМ альбумина, можно заключить,что в среднем 1 М альбумина «инактивирует» 1,43 мМ зомана за 60 мин.Таблица 3.14.Количество связанного зомана 145,6 мкМ альбумина (ЧСА)Зоманвремямг/млмкМ-630 мин7,04×100,039-560 мин3,41×100,187-52ч4,50×100,247-54ч3,06×100,16886Расчет субстратной константы для ферментативного взаимодействияБСА с зоманом по данным метода Эллмана.
Для определения константы,характеризующей связывание зомана и БСА, проводили эксперимент поопределению скорости гидролиза зомана БСА в зависимости от концентрациизомана в реакционной смеси. Приготовление растворов описано в разделе 2(МиМ). Скорость гидролиза зомана альбумином рассчитывали как разницумежду концентрациями «общего» и «свободного» зомана деленную на 60 мин.Полученные данные вносили в программу GraphPad Prism, трансформировали вдвойные обратные координаты, используя модель обработки данных поЛайнуиверу-Берку, и строили аппроксимирующую линию с расчетом угланаклона и координатами пересечения с осями X и Y. Угол наклона прямойравен Km/Vmax.
Отрезок, отсекаемый на оси Y равен 1/Vmax, отрезок, отсекаемыйна оси X равен -1/Km.Обнаруженные и описанные в научной литературе аддукты зомана сальбумином очень стабильны. Период полужизни аддукта зомана с Tyr411 ЧСАсоставляет по разным данным от одной до трех недель [121]. Значениеконстанты скорости гидролиза зомана в присутствии альбумина на два порядкавыше значения константы скорости реактивации Tyr411, что позволяетпредположить существование двух независимых процессов: ферментативногогидролизазоманаобразованиемальбуминомковалентногоисвязываниестабильногозоманааддуктаальбуминомс(псевдоэстеразнаяактивность).
Для того чтобы оценить способность БСА удалять из реакционнойсреды зоман, нужно отслеживать снижение концентрации зомана с течениемвремени с момента начала его взаимодействия с БСА. Снижение концентрациизомана в присутствии БСА оценивали биохимическим методом путемопределения способности реакционной смеси ингибировать АХЭ. В ходерасчетов учитывали процесс спонтанного гидролиза зомана и незначительнуюактивность БСА в отношении субстрата для АХЭ. Оценку степениингибирования АХЭ проводили планшетным вариантом метода Эллмана [9].87По результатам проведенных исследований были построены графикиСкетчарда и Лайнуивера-Берка, представленные на рисунках 3.20 и 3.21.Согласно расчету для одного сайта связывания, Bmax=231,9±6,5мкМ иKd=46,1±6,2мкМ;длядвухсайтовсвязыванияBmax1=37,8±5,5мкМ,Kd1=3,2±1,2мкМ, Bmax2=211,3±22,1мкМ, Kd2=90,1±12,4мкМ. По результатамприменения формализма Михаэлиса-Ментен ко всему диапазону исследуемых-1концентраций зомана, Km=4,1мкМ, Vmax=0,013мкМ∙мин .
При разделении надва диапазона концентраций (точка раздела 0,56 мкМ) показатели для условно-1«низких» концентраций: Km1=0,166мкМ, Vmax1=0,0014мкМ∙мин ; для условно-1«высоких»: Km2 =46,3мкМ, Vmax2 =0,09мкМ∙мин . Уточнение этих показателейвозможно, во-первых, при работе с насыщающими концентрациями зомана (аэто означает существенное превышение – на несколько порядков токсикологически релевантных концентраций), во-вторых, путем измеренияскоростейобразованиядвухпродуктовреакции-фторид-ионаипинаколилметилфосфоновой кислоты – в рамках одного эксперимента сиспользованиемселективныхингибиторовипрецизионныххимико-аналитических методов. Трудности интерпретации и соотнесения полученныхданных с тем или иным сайтом обусловлены необходимостью работы сненасыщающими концентрациями зомана. Мы полагаем, что показатели,свидетельствующие о более высоком сродстве с низкой скоростью реакции иконечной емкостью (Km1, Kd1, Vmax1, Bmax1), характеризуют сайт Садлоу II, тогдакак показатели, свидетельствующие о более низком сродстве с высокойскоростью реакции и конечной емкостью (Km2, Kd2, Vmax2, Bmax2), характеризуютсайт Садлоу I.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
