Диссертация (1145807), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Биохимическое исследованиевлияния ингибитора карбоксилэстераз НФФ на (псевдо)эстеразную активностьальбумина показано, что НФФ взаимодействии исключительно с одним сайтомЧСА. Температурная обработка альбумина позволила установить, чтоактивностьальбуминазависитотцелостностиегопространственнойструктуры: денатурированный альбумин теряет способность связываться сбромкрезоловым зеленым и детектируется как обычный белок.
В экспериментепо связыванию зомана с нативным и денатурированным альбумином выявлено,что в среднем 1 мМ нативного альбумина «инактивирует» 1,49 мкМ зомана, вто время как 1 мМ денатурированного альбумина – лишь 0,21 мкМ зомана, т.е.в 7 раз меньше.Определение кинетических характеристик фермента, имеющего болееодного центра (псевдо)каталитической активности, является довольно важнойпроблемой.
Применение известных программ для обработки первичных данных(напр., GraphPad Prism) может привести к неправильной интерпретацииколичественных величин, характеризующих кинетические характеристики,соответствующие«классической»кинетикеМихаэлиса-Ментен.Дляпроведения сравнительного анализа трех видов альбумина, пониманиямеханизма реакции, катализируемой альбумином, и количественной оценки еёкинетических параметров мы разработали собственный алгоритм на основемодели расщепления НФА альбумином [19], ацилферментативной моделирасщепления НФА химотрипсином [29], модели гидролиза НФА липазой [58],модели ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями[128].
Механизм взаимодействия эфиров с альбумином включает в себя двесоставляющие – предстационарное и стационарное состояния, кинетикакоторых соответствуют активности не менее двух сайтов альбумина - Садлоу IIи Садлоу I, соответственно. На предстационарной стадии выход продукта123представляет собой реакцию (псевдо)первого порядка в течение почти 95%времени фазы «всплеска». Скорость деацетилирования сайта Садлоу II k3 поменьшеймерев100разнижескоростиацетилированиятирозина.Стационарное состояние (кинетика Садлоу I) описывается уравнением типаи может быть использована для линейного регрессионного анализа.Определив наклон прямой и её пересечение с осью ординат, мы расчитываликинетические и равновесные константы k2, k3, Ks иСайтСадлоу Iкрысиного.альбуминаобладаетнаибольшейкаталитической эффективностью по отношению к НФА, которая примерно в 2раза выше по сравнению с альбумином человека и в 5,5 раз вышекаталитической эффективности бычьего альбумина.
Эти различия обусловленынеодинаковым сродством сайта Садлоу I исследуемых альбуминов к субстрату,т.к. число оборотов у них одинаково. Различия в константах ингибированияКСA и ЧСA в сайте Садлоу II незначительны, тогда как этот показатель у БСАболее чем в 2 раза выше, что также обусловлено более высоким сродствомсайта Садлоу II БСA к субстрату.Ингибиторный анализ БСА с использованием НФА в качестве субстратапоказал,чтоисключительноибупрофенскоростьиНФФ,какипредстационарногопредполагалось,состояния.Приподавляютдействииварфарина характер наклона кинетических кривых на ранних стадияхсущественно не меняется, наблюдается даже тенденция к повышению скорости(особенно при малых концентрациях НФА), что может быть обусловленоаллостерическим влиянием варфарина на сайт Садлоу II.
В то же время,некоторое снижение скорости гидролиза НФА на второй стадии (стационарнаяфаза) наблюдается лишь при высоких концентрациях варфарина и субстрата.Это соответствует данным докинга об относительно слабой специфичностиварфарина по отношению к сайту Садлоу I.Результаты сравнительных исследований показали, что в сайте Садлоу IIсродство ибупрофена максимально у КСА, в 2 раза меньше у ЧСА и в 4 разаменьше у БСА. Установлено, что ибупрофен ингибирует эстеразную реакцию в124сайте Садлоу I. Ибупрофен может выступать в роли аллостерическогоингибитора, поскольку анализ данных не выявил наличия у ибупрофенасвойств конкурентного ингибитора эстеразной реакции в сайте Садлоу I.
Вотличие от сайта Садлоу II, ингибирующая способность ибупрофена в сайтеСадлоу I максимальна у БСА, примерно в 2 раза меньше у КСА и в 4 разаменьше – у ЧСА.Варфарин обладает наибольшим сродством к сайту Садлоу I КСА, тогдакак сродство к Садлоу I БСА и ЧСА в 150-200 раз (!) меньше.Однаконаибольшую ингибирующую способность, характеризуемую соотношениеммаксимальной скорости ингибирования к константе ингибирования (ki/Ki),варфарин демонстрировал с альбумином человека, далее следует крысиныйальбумин (в 1,5-2 раза меньше) и бычий альбумин (в 3 раза меньше). В отличиеот ибупрофена, варфарин не ингибировал сайт Садлоу II.Такимобразом,ингибиторныйанализобоихсайтовСадлоусиспользованием НФА в качестве субстрата позволил получить дополнительныесвидетельства того, что функциональные характеристики человеческого икрысиного сывороточного альбумина отличаются между собой в меньшейстепени по сравнению с функциональными характеристиками бычьегоальбумина.
Кроме того, дополнительно подтверждается предположение оконсервативности сайта Садлоу II по сравнению с сайтом Садлоу I.Поотношениюкпараоксону,всайтеСадлоуIнаибольшейкаталитической эффективностью из трех видов альбумина обладает БСA,который в 4,1 и 5,3 раза активнее по показателю k3/Kmapp, чем КСA и ЧСA,соответственно. Функциональные характеристики сайта Садлоу I крысиного ичеловеческого альбумина ближе между собой, что мы наблюдали также и сНФА в качестве субстрата.
Сайт Садлоу II имеет более высокое сродство кпараоксону по сравнению с Садлоу I: его равновесная константа нижеустановленной для Садлоу I в 200, 500 и 560 раз для ЧСA, БСA и КСA,соответственно. При этом аффинность Садлоу II всех трех видов альбумина кпараоксону выше аффинности к НФА примерно в 1,5, 2,5 и 3 раза для ЧСA,125КСA и БСA, соответственно. Константа скорости фосфорилирования k2практически не отличается от константы скорости ацетилирования с НФА вкачестве субстрата. Расчет бимолекулярной константы ингибирования даётоснования заключить, что сайт Садлоу II БСA существенно быстрее образуетковалентные связи с диэтилфосфатным остатком по сравнению с ЧСA и КСA(примерно в 5 и 3 раза), формируя ковалентные аддукты.
Другой важный выводсостоит в том, что фосфорилирование сайта Садлоу II всех трех видовальбуминапривзаимодействииспараоксономпроисходитбыстрееацетилирования этих сайтов, хотя для ЧСA эта разница несущественна.Ибупрофен ингибировал параоксоназную реакцию в сайте Садлоу I.Поскольку ибупрофен не способен напрямую взаимодействовать с сайтомСадлоу I, он выступает в роли аллостерического регулятора. Обработка данныхматематическими (нелинейный регрессионный анализ) и графическимиметодами (метод Лайнуивера-Берка, Корниш-Боудена и Диксона) определеннеконкурентный тип ингибирования ибупрофеном реакции расщепленияпараоксона в сайте Садлоу I.
В то же время, мы не выявили ингибирующеговлияния ибупрофена на параоксоназную реакцию в сайте Садлоу II. Очевидно,главной причиной установленного феномена является более высокое сродствопараоксона к сайту Садлоу II (Ks параоксона ниже примерно на 2 порядка Kiибупрофена с НФА в качестве субстрата).Варфарин не оказывал ингибирующего влияния на активность обоихсайтов, в первую очередь сайта Садлоу I всех трех видов альбумина поотношению к параоксону. Очевидно, при высоких концентрациях параоксонаварфарин не может эффективно конкурировать с ним, при том что аффинностьпараоксона к сайту Садлоу I на уровне субстратной константы первого этапавзаимодействия, согласно схеме 1 (раздел 3.2), может быть достаточновысокой.
Величина кажущейся Km (табл.3.10) не отражает первичнуюаффинность, т.к. она получена с учетом скоростей прямой и обратной реакцийвторогоэтапавзаимодействия,атакжеферментативной реакции в сайте Садлоу I.числаоборотовусловно126Данные сравнительного биохимического анализа трех видов альбумина сиспользованием НФА и параоксона в качестве субстратов свидетельствуют отом, что равновесные и кинетические характеристики обоих сайтов СадлоуЧСА и КСА довольно близки между собой, но существенно отличаются отаналогичных характеристик БСА.
Карбоксилэстеразные характеристики сайтаСадлоу II ЧСA и КСA практически одинаковы, тогда как параоксоназныехарактеристики лишь незначительно отличаются между ЧСA и КСA.Ингибиторный анализ обоих сайтов Садлоу с использованием НФА ипараоксона в качестве субстратов также свидетельствует о том, чтофункциональные характеристики ЧСA и КСA отличаются между собой вменьшей степени по сравнению с функциональными характеристиками БСА.Результаты наших исследований подтверждают предположение, основанное наданных об уровне аминокислотной идентичности сайтов, о консервативностисайта Садлоу II по сравнению с сайтом Садлоу I исследованных видовальбумина.
Полученные результаты также свидетельствуют о том, что БСА вцелом более консервативен с эволюционной точки зрения по отношению к ЧСАи особенно к КСА.ИсследованиеингибированияНФА-активностиальбумина(ЧСА)зоманом показало, что даже при избытке зомана по отношению к альбуминуего НФА-активность ингибируется не более чем на 40%. Это свидетельствует отом, что гидролиз НФА происходит не в одном сайте ЧСА.количествасвязавшегосясальбуминомзоманавОпределениененасыщающихконцентрациях по остаточному ингибированию АХЭ зоманом позволилоустановить, что 1 мМ альбумина может инактивировать 1,43 мкМ зомана за 120мин.По остаточному ингибированию АХЭ после инкубации зомана с БСАпроводили расчет равновесных и кинетических показателей, характеризующихкаталитическую и стехиометрическую активность альбумина по отношению кзоману.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
