Диссертация (1145717), страница 24
Текст из файла (страница 24)
29. Оценка активации главных обонятельных луковиц (по изменению уровня BOLDконтраста) (М ± SE, %) самцов мышей BALB/c в ответ на предъявление хемосигналовсамок-одиночек (ХСО) и «ДМП» – 2,5-ДМП.(А), (Б) Примеры динамики изменения уровня BOLD относительно базального припредъявлении 2,5-ДМП (А) и подстилки самок (Б). Серыми пунктирными линиямиобозначен диапазон, в котором располагаются экспериментальные значения BOLDконтраста, сплошной линей показано экспериментальное значение.(В)АмплитудаизмененияBOLD-контраста(%)припредъявленииразличныхольфакторных стимулов.(Г) Синие столбцы – площадь областей (пиксели) на срезе обонятельной луковицы,снизивших потребление кислорода при предъявлении запаховых стимулов, красныестолбцы - площадь областей на срезе обонятельной луковицы, увеличивших потреблениекислорода при предъявлении запаховых стимулов.Для множественного сравнения средних использован LSD-тест (между столбцами,помеченными разными буквами (a,b,c), выявлены достоверные различия – p<0,05).109При анализе карт активации зон обонятельных луковиц (рис.30), несмотря натенденцию перекрывания зон активации (при предоставлении хемосигналов самокодиночек) и инактивации (при предоставлении 2,5-ДМП) не было выявлено достоверныхзон, которые бы консервативно и постоянно отвечали бы на предоставляемый стимул.Рис.
30. Изменение уровня BOLD-контраста в главных обонятельных луковицах в ответна предъявление самцам BALB/c запахового стимула (серые полосы), по сравнению сбазальным уровнем.Изменение уровня BOLD в ответ на предоставление (А) 2,5-ДМП; (Б) подстилки самокодиночек.(В), (Г) Области обонятельных луковиц, увеличивающие активность («зоны активации»)(В) и снижающие активность («зоны инактивации») (Г) в ответ на совместноепредъявление 2,5-ДМП и ХСО.На рисунке также обозначены соответствующие карты активации нейронов обонятельнойлуковицы. Величина (T) – величина изменения активности нейронов (красно-оранжевая –активация, синяя - инактивация).Таким образом, выявлено снижение активности нейронов обонятельных луковицпри действии 2,5-ДМП, и ее повышение при действии ХСО. Одновременное применение2,5-ДМП и ХСО приводило к частичной нейтрализации эффектов.1103.10.
Эксперимент 11. Исследование роли обонятельного эпителия вцитогенетических эффектах феромона 2,5-ДМП и хемосигналов самок-одиночек настабильность хромосомного аппарата клеток костного мозга самцов мышей линииСВАДля конкретизации роли обонятельных путей в наблюдаемых генетическихэффектах был проведен эксперимент с временной инактивацией обонятельных зон спомощью интраназального введения солей сульфата цинка (ZnSO4) и последующегопредоставленияхемосигналов2,5-ДМПиХСО.Экспериментыпроводилинаполовозрелых самцах линии СВА, в каждой группе было не менее 5 особей. В качествехемосигналов использовали 2,5-ДМП и хемосигналы самок-одиночек CBA (ХСО).Анализ результатов показал, что в некоторых группах («K», «Zn ХСО») данныебыли распределены не нормально, однако данные внутри всех групп были гомогенны.Поэтому внутри групп данные были объединены, а за единицу варьирования принималиклетку.
Для межгрупповых сравнений использовали многопольный критерий χ2.Рис. 31. (А) Частота нарушений митоза (НМ) (%) в клетках костного мозга самцов мышейлинии СВА при действии 2,5-ДМП «ДМП» или хемосигналов самок-одиночек «ХСО»,при предварительной обработке 10%-сульфатом цинка «Zn» или физиологическимраствором. Под графиком указаны соотношения числа нарушений митозов (НМ) кколичеству нормальных делений(НормД) – для каждой группы. Сверху скобкамиуказаны достоверно различающиеся группы и уровень значимости различий, критерий χ2.(Б) Спектры различных нарушений митоза, у контрольной группы при действии 2,5-ДМП,ХСО, а также сульфата цинка.111В контрольной «К» группе уровень НМ составил 4,73% (рис. 31, «А»).
При этомзакапывание в нос сульфата цинка «Zn K» не привело к изменению частоты НМ, уровенькоторых в этой группе составил 4,16%. Важно учитывать, что мышам, которым в нос незакапывали раствор соли цинка, закапывали физиологический раствор для выравниванияусловий эксперимента. Закапывание в нос проводили за 3 дня до начала запаховыхвоздействий.Воздействие ХСО привело к достоверному снижению уровня НМ по сравнению сконтрольным «К» (p=0,02), частота НМ в группе «ХСО» составляла 2,92%. При этомчастота НМ у мышей, которым перед воздействием ХСО закапывали в нос соли цинка «ZnХСО», составляла 5,33%, не отличалось от контроля «К», и была достоверно выше, чем угруппы ХСО (p=0,0003) (рис. 31, «А»).Инактивация обонятельного эпителия также приводила к полному исчезновениюэффекта 2,5-ДМП (рис.
31, «А»). Если у группы с нормальным обонянием, на которуюосуществляли воздействие 2,5-ДМП («ДМП»), частота НМ составляла 10,44% (отличия отвсех остальных групп достоверны, p<0,0001), то предварительное воздействие сульфатомцинка (группа «Zn ДМП») не изменяло частоту НМ 3,42%, по сравнению с контрольнымзначением.Анализ соотношений отдельных типов нарушений не выявил достоверныхизменений в спектре нарушений митоза.
Основными типами НМ у животных всех группбыли одиночные мосты и одиночные фрагменты. На рис. 31, «Б» представлены типичныеспектры групп «K», «Zn K», «ХСО» и «ДМП».Таким образом, показано, что предварительная инактивация всех обонятельных зонпредотвращала как дестабилизирующий геном эффект 2,5-ДМП, так и протекторныйэффект ХСО.3.11. Эксперимент 12. Исследование влияния хемосигналов самок-одиночек начастоту спонтанных нарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии СВАПоскольку ранее мы уже демонстрировали протекторную способность ХСО, былапоставлена ещё одна дополнительная повторность эксперимента по исследованиювлияния хемосигналов самок-одиночек (ХСО) линии CBA на уровень спонтанных НМ усамцов мышей линии СВА.
Данные в обеих группах были распределены нормально и иханализировали с помощью t-критерия.112Рис. 32. (А) Частота нарушений митоза (M ± SE, %) в клетках костного мозга самцов СВАпри 24-часовом воздействии хемосигналов самок-одиночек «ХСО»; «К» – контроль. Надграфиком указан уровень значимости, t-критерий.
(Б) Спектры различных нарушениймитоза, у контрольной группы и при действии ХСО.Частота нарушений митозов у животных контрольной группы «К» составила 4,3%(рис. 32, «А»). Воздействие ХСО снизило частоту нарушений в 1,6 раза (отличия отконтроля достоверны, p<0,0001) до уровня 2,74%.При этом не было выявленомежгрупповых различий по спектрам отдельных типов нарушений митоза (рис.
32, «Б»). Вконтрольной группе основным типом нарушений были одиночные фрагменты, их долясоставила 43%, а в группе «ХСО» – одиночные мосты, доля которых составила 44%.Таким образом, была подтверждена способность ХСО снижать уровень спонтанныхнарушений митоза. Однако оставалось неясным, распространяется ли протекторныйэффект ХСО на действие физических мутагенов, например, рентгеновского облучения.3.12.
Эксперимент 13. Исследование влияния хемосигналов самок-одиночек начастоту радиоиндуцированных нарушений митоза в клетках костного мозга самцовлинии СВАПомимо изучения влияния ХСО на возникновение спонтанных НМ было проведено2 повторности эксперимента по выявлению возможности ХСО снижать частотунарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии СВА, вызванных облучением(рис. 33).113Рис. 33. Частота нарушений митоза (М ± SE, %) в клетках костного мозга самцов мышейлинии СВА через 24 ч после тотального рентгеновского облучения в дозе 4 Грея «4Гр»или сочетанного действия облучения и ХСО «4Гр+ХСО»; «К» – животные контрольнойгруппы.
(А) – Первая повторность эксперимента; (Б) – вторая повторность эксперимента.Звездочками помечены достоверно различающиеся группы («**» – p<0,01; «***» –p<0,001; «****» – p<0,0001), критерий ANOVA. Под графиком показан спектр отдельныхтипов нарушений каждой из групп, а также достоверно различающиеся спектры («*» –p<0,05; «**» – p<0,01; «***» – p<0,001 Критерий χ2). Цвета спектров обозначаютотдельные типы нарушений, как и на рис.
32, «Б».Анализ результатов обеих повторностей показал нормальное распределение данныхвнутри групп, поэтому для выявления различий использовали критерий ANOVA. Былавыявлена общая закономерность в цитогенетическом ответе клеток костного мозга надействующие факторы.В первой повторности уровень НМ в контрольной группе «К» составил 2,4%, вовторой – 4,3% (рис. 33, «А», «Б»). В обеих повторностях облучение в дозе 4 Гр «4Гр»привело к значительному росту частоты НМ через 24 часа после облучения.
Уровень НМвырос на 14% до 16,4% в первой и до 18,2% – во второй повторности (отличия отконтроля достоверны, p<0,0001). При этом действие ХСО в течение 24 часов послезавершения облучения (группа «4Гр+ХСО») достоверно снижало частоту НМ, посравнению с группой «4Гр», до уровня 7,9% в первой повторности (отличие от группы«4Гр» достоверно, p<0,0001) и до 11,3% во второй повторности. При этом частота НМ в114группе «4Гр+ХСО» обеих повторностей оставалась достоверно выше контрольныхзначений.Анализ спектров отдельных типов НМ в первой повторности показал достоверныеотличия между спектрами всех групп (рис. 33, «А», «Б»). У облученных групппроисходило повышение доли множественных перестроек. Так, если у группы «К» онасоставляла 20%, то в группе «4Гр» – 50%, а в группе «4Гр+ХСО» – 44% от всехвыявляемых типов перестроек.
Увеличение доли множественных перестроек происходилоза счет снижения доли одиночных мостов и отставших хромосом.Во второй повторности спектры нарушений обеих облученных групп не различалисьмежду собой, но при этом отличались от спектра контрольной группы (рис. 33, «Б»). Былавыявлена аналогичная тенденция к увеличению количества множественных перестроек: у«К» она составляла 25%, в группе «4Гр» – 45%, а в группе «4Гр+ХСО» – 51%.
При этомувеличение доли множественных перестроек происходило за счет снижения долиодиночных фрагментов. Если в контрольной группе их было 43%, то в группах «4Гр» –27%, а в группе «4Гр+ХСО» – 17%. При этом во второй повторности доли одиночныхмостов и отставших хромосом практически не менялись.Таким образом, в 2-х независимых повторностях эксперимента было показано, чтовоздействие ХСО может снижать частоту радиоиндуцированных нарушений митозов.115ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕВ работе было проведено 13 экспериментов для изучения влияния различныхстрессоров, в особенности – ольфакторных, на стабильность генома клеток костного мозгадомовой мыши, выяснить внутриорганизменные пути дестабилизации генома клеток пристрессе, а также изучить возможность стабилизировать геном клеток при помощи другихольфакторных стимулов (ХСО).В работе исследовали возможность дестабилизировать геном при действииразличных стрессоров: ольфакторных воздействий 2,5-диметилпиразина (2,5-ДМП) вблизкой к естественной концентрации (Novotny et al., 1986), хемосигналов мочи кошки(МК), а также – иммобилизации.
Стабильность генома изучали в клетках костного мозга,поскольку клетки этой ткани, с одной стороны, часто делятся (и в них удобно оцениватьчастоту нарушений митоза), а с другой стороны, генетические повреждения клеток этоговажногоорганаиммуннойикроветворнойсистемприводятксущественнымфизиологическим последствиям (Jaiswal et al., 2014; Goodell, Rando 2015; Moehrle, Geiger,2016).Ана-телофазный метод позволяет выявлять эффектусиления хромосомнойнестабильности, который также называется кластогенным (Kovalchuk et al., 1998).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
