Диссертация (1145717), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Это приводит к тому,что все клетки крови разделяются на большое количество микрофракций с уникальнымнабором соматических мутаций, в зависимости от их ГСК-предшественника (Welch et al.,2012). Кроме того, известно, что в молодости у человека за всё кроветворение ииммунопоэз отвечают около 1000 активных ГСК (Catlin et al., 2011), а при старениипроисходит существенное снижение количества ГСК, участвующих в кроветворении,вплоть до полного моноклонального гематопоэза, который наблюдают у 5-20% 70-летнихлюдей, и практически у всех людей старше 90 лет (McKerrell, Vassiliou, 2015). Повидимому, этот процесс происходит именно из-за соматического мутагенеза, приводящегок селекции ГСК.Интересно, что при моноклональном гематопоэзе наиболее часто происходятмутации в генах DNMT3A и TET2.
Продукты данных генов регулируют статусметилирования ДНК, и мутации в DNMT3A и TET2 приводят к ускорению деленийстволовыхклеток(собразованиемновыхстволовыхклеток),препятствуютдифференциации ГСК, а также встречаются при многих злокачественных раках крови(Challen et al., 2011; Koa et al., 2011; Quivoron et al., 2011). Третьим по частотемутирования при моноклональном гематопоэзе является ген TP53, а его продукт – белокp53 – служит ключевым клеточным фактором, поддерживающим стабильность генома ииндуцирующим апоптоз в случае геномной нестабильности (Kandoth et al., 2013). Повидимому, наличие мутаций в генах DNMT3A, TET2 и TP53 способствуют повышеннойвыживаемости клеток и успешной селекции клонов, имеющих данные мутации.Мутагенез в ГСК к 70-ти годам приводит к накоплению около 700 индивидуальныхмутаций, большая часть из которых является нейтральными (Welch et al., 2012; Goodell,Rando 2015).
Значимые мутации с высокой долей вероятности приведут к арестуклеточного цикла (и переходу в состояние клеточного старения – сенессенса) илиапоптозу. То, что физиологические воздействия, приводящие к мутагенезу ГСК,усиливают в дальнейшем и апоптоз, было показано при действии различных факторов,выводящих ГСК из состояния покоя (полиинозиновая-полицитидиловая (Пл-Пц) кислота,123интерферон-α, гранулоцит-колониестимулирующий фактор, кровопотеря) (рис. 3, «Б»;Walter et al., 2015).Таким образом, высокая скорость мутагенеза у ГСК обуславливает селекцию,приводя к отбору клеток с мутациями в генах, способствующих ускорению клеточныхделений, а также – мешающих клетке уйти в апоптоз.Возможно, одной из причин, приводящих к усиленному накоплению мутаций встволовых клетках костного мозга, и являются быстро возникающие при стрессеповреждения ДНК, описанные в данной работе.Отдаленными последствиями соматического мутагенеза клеток костного мозга иклональной селекции ГСК может быть возникновение ряда патологий.
Так, у людейсокращение пула активных ГСК может приводить к достоверному повышению рисказаболеваний крови, например, миелодиспластического синдрома, апластической анемии илейкемии (Jaiswal et al., 2014). Более того, у людей с низко-клональным гематопоэзомнаблюдают повышенный риск смертности от всех причин, а также – происходитувеличение риска инфаркта миокарда и инсульта (Jaiswal et al., 2014). Кроме того,некоторые возрастные заболевания, такие как диабет 2-ого типа, также ассоциированы сгеномной нестабильностью в клетках крови (Bonnefond et al., 2013). По-видимому,накопление повреждений в клетках костного мозга является одной из основных причинстарения этой ткани (Moehrle, Geiger, 2016).Биологическая роль выявленного всплеска дестабилизации генома клеток костногомозга при стрессе остается неясной.
При этом можно предположить, что подобныйвсплеск генетической нестабильности происходит не только в клетках костного мозга.Так, показано, что острый стресс приводит к увеличению частоты двунитевых разрывов вкардиомиоцитах (Mikhailov, Vezhenkova, 2007); к усилению фрагментации ДНК в клеткахслизистой оболочки печени и желудка (Bagchi et al., 1999), амигдалы и гиппокампа(Consiglio et al., 2010), и что особенно важно – в клетках семенников (Даев, 2006). Такимобразом,представляетсявероятным,чтоострыйстрессможетиндуцироватьгенетическую нестабильность в целом ряде тканей, в том числе и в генеративных клетках.Быстрое увеличение генетического разнообразия в генеративных клетках, и как следствие,в потомстве, может являться адаптивно полезным фактором, увеличивая шанс появленияновых адаптивных признаков. Побочным влиянием генетической нестабильности вгенеративных клетках было бы повышенное количество эмбриональной и младенческойсмертности, что и наблюдается в случае воздействия 2,5-ДМП (Даев, Дукельская, 2004;Jemiolo, Novotny, 1993).
В свете всего вышесказанного, можно предположить, чтодестабилизация генома при стрессе в генеративных клетках может приводить к124увеличению разнообразия потомства, а наблюдаемая нами дестабилизация генома всоматических клетках может приводить к усилению дифференциальной смертностиорганизмов и элиминации из популяции не адаптированных к стрессору генотипов.Следующим этапом данной работы было изучение механизмов, посредствомкоторых ольфакторные воздействия могут привести к дестабилизации генома клетоккостного мозга самцов мышей. Для данной цели был изучен гормональный ответ надействие 2,5-ДМП: были исследованы изменения концентрации гормонов стресса(кортикостерона), а также половых гормонов (ЛГ, тестостерона и окситоцина) (рис. 26).Выбор кортикостерона был обусловлен тем, что он является главным эффекторнымгормоном оси ГГН, и повышение его концентрации является свидетельством развитияорганизменногостресса.Приэтомкосвенныеданныеуказывалинато,чтогенотоксические эффекты 2,5-ДМП обусловлены развитием стресс-реакции (например,возникновение НМ сопровождалось исчезновением норадреналина из периферическихнервных окончаний) (Даев и др., 2000).Выбор для исследования половых гормонов был обусловлен тем, что 2,5-ДМПявляется хемосигналом самок (выделяемый ими при переуплотненном содержании)(Novotny et al., 1986; Andreolini et al., 1987), и можно было предположить, что он будетоказывать полоспецифичные эффекты на самцов.
Кроме того, было известно, чтохемосигналы самок вызывают у самцов резкий выброс ЛГ и тестостерона (Maruniak,Bronson, 1976), что обусловило наш выбор этих гормонов для анализа изменения ихконцентраций в плазме крови. Также для исследований был выбран окситоцин, посколькуон оказывает сильное влияние на процесс распознавания запаха самок самцами мышей(Samuelsen, Meredith, 2011).Поскольку 2,5-ДМП является одной из основных молекул, активно выделяемыхсамкамиприпереуплотненномсодержании,товэкспериментеиспользовалидополнительное воздействие хемосигналами самок, рассаженных поодиночке (ХСО),которые почти не содержат 2,5-ДМП (Novotny et al., 1986).
Эффект 2,5-ДМП сравнивали сэффектом ХСО, для того, чтобы оценить специфичность гормонального ответа именно наэту молекулу, в отличие от ответа на хемосигналы самок в целом.Концентрация гормонов была исследована при 30- и 60-минутном воздействиихемосигналами. Выбор временных точек был обусловлен тем, что при действиибольшинства стрессоров пик выброса глюкокортикоидов происходит через 15-30 минут, ачерез 60 минут воздействия часто отмечается снижение их концентрации (Siegel et al.,1980; Windle et al., 1998).125В результате было установлено, что при 30-минутном воздействии 2,5-ДМПпроисходило достоверное повышение уровня кортикостерона более чем в 25 раз, посравнению с контролем, при этом через 60 минут воздействия концентрациякортикостерона опускалась до контрольных значений (рис.
26, «А»). Данные результатывпервые однозначно продемонстрировали, что при предоставлении 2,5-ДМП развиваетсястресс-реакция. При этом было обнаружено, что ещё одним эффектом 2,5-ДМП былоснижение концентрации окситоцина в 2,6 раза при 60-минутном (но не 30-минутном)воздействии (рис. 26, «Б»). Известно, что окситоцин активирует антиоксидантную защитуклеток (Szeto et al., 2008), препятствует выделению АКТГ и глюкокортикоидов (Hartwig,1989), и может рассматриваться как анти-стресс гормон (Uvnas, 1998).
Интересно, чтовведение окситоцина крысам снижало силу повреждения ДНК в клетках лимфоцитовкрови,вызванногохроническимвведениемкортикостеронаидополнительноиндуцированного перекисью водорода (Stanic et al., 2016). Таким образом, можнопредположить, что снижение окситоцина при одночасовом воздействии– этодополнительный фактор усиления стресс-реакции при действии 2,5-ДМП.Интересно, что одновременное воздействие 2,5-ДМП и ХСО (как и воздействиетолько ХСО) не приводило изменению концентрации кортикостерона и окситоцина, посравнению с контролем, что может говорить о нейтрализующем эффекте ХСО (рис.
26,«А», «Б»).Важно отметить, что ни одно из воздействий не повлияло на концентрацию половыхгормонов – ЛГ и тестостерона (рис. 26, «В», «Г»). С одной стороны, это может бытьсвязано с сильной гетерогенностью полученных данных, а с другой – с недостаточнымколичеством выборки. В оригинальных исследованиях, показывающих увеличениеконцентрации ЛГ и других половых гормонов у самцов в ответ на действие мочи самок(Maruniak, Bronson, 1976), количество самцов в каждой группе превышало 15, а в нашемисследовании было не более 8-ми самцов на экспериментальную группу.Чтобы подтвердить роль стресс-гормонов в формировании генотоксическихэффектов стресса, было проведено 2 эксперимента на самцах линии CBA сиспользованием фармакологических блокаторов действия стресс-гормонов (табл.
2, рис.27). В качестве стрессирующих воздействий были выбраны 2-часовое воздействиехемосигналом 2,5-ДМП и иммобилизацией. В качестве блокатора оси ГГН был выбранметирапон, который широко применяют в исследованиях для подавления синтезаглюкокортикоидов (Young et al., 2007; Filaretova et al., 2012; Kollet et al., 2013; Zimprich etal., 2014).
Поскольку предыдущий эксперимент выявил, что при предоставлении мышам2,5-ДМП развивается стресс-ответ (рис. 26, «А») было решено заблокировать и другой126путь действия стресса, затрагивающий катехоламины. Кроме того, было известно, чтовоздействие2,5-ДМПприводиткполномуисчезновениюнорадреналинаизадренергических нервных волокон различных тканей (Даев и др., 2000), что также говорито возможном участии катехоламинов в генотоксических эффектах 2,5-ДМП.В качестве фармакологического блокатора действия катехоламинов был выбран βадреноблокатор – пропранолол, который блокирует действие адреналина и норадреналиначерез β-адренорецепторы всех типов. Ранее было показано, пропранолол можетблокировать повреждения ДНК, вызванные хроническим иммобилизационным стрессом(Hara et al., 2013).Воздействие метирапоном приводило к достоверному снижению частоты НМ,вызванных как 2,5-ДМП, так и иммобилизацией (до уровня, не отличающегося отконтрольного)(рис.27,«А»,«Б»).Воздействиепропранололомприводилокдостоверному снижению частоты НМ, вызванных иммобилизацией (до уровня, неотличающегося от контрольного) (рис.
27, «Б»). Однако при действии 2,5-ДМП ипропранолола снижение частоты НМ не было достоверным и продолжало отличаться отконтрольного уровня (рис. 27, «А»). Воздействия самих блокаторов (пропранолол илиметирапон) не приводили к генотоксическому эффекту на клетки костного мозга (рис. 27,«А», «Б»). Можно также отметить, что хотя эффект от совместного действия стрессоров иметирапона и переставал отличаться от контрольных значений, он все равно был немноговыше, по сравнению со «спонтанным» уровнем нарушений в контрольной группе (рис. 27,«А», «Б»).Можно предположить, что вызванное пропранололом снижение частоты НМ былостатистически значимым при действии иммобилизации и не было таковым при действии2,5-ДМП из-за различий в силе их стрессирующего воздействия. И на мышах линии С3Н ина мышах линии СВА 2,5-ДМП всегда оказывал немного более сильный генотоксическийэффект, по сравнению с иммобилизацией, (хотя различия и не были статистическизначимыми) (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
