Диссертация (1145717), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Одним из возможных внутриклеточных путей, через которые можетосуществляться эффект 2,5-ДМП, является активация цитохромов p450 (ферментов,участвующих в обмене стероидов, желчных и ненасыщенных жирных кислот, фенольныхметаболитов, а также – в нейтрализации ксенобиотиков). Показано, что микросомальнаяфракция клеток печени самцов линии СВА, которым предъявляли 2,5-ДМП, показывала119больший потенциал к промутагенной активации 2-аминофлюорена (за счет активациисистем цитохромов) в тесте Эймса (Zhuk et al., 2011).На следующем этапе работы мы исследовали, является ли эффект быстройдестабилизации генома, индуцированный 2,5-ДМП, уникальным для этого феромона, илиже он характерен и для других стрессирующих воздействий.
Для этого мыпроанализировали влияние на стабильность генома клеток других стрессоров мыши: какполностью неинвазивных (хемосигналы мочи коши), так и требующих физическогоконтакта с животными (иммобилизация). Сравнение эффектов 2,5-ДМП с даннымистрессорами было обусловлено, с одной стороны, тем, что ряд косвенных данныхуказывал на то, что 2,5-ДМП индуцирует стресс у особей-реципиентов. Так, например,секреция 2,5-ДМП находится под контролем надпочечников (Novotny et al., 1986),эффекты данного феромона угнетают репродукцию (Jemiolo, Novotny, 1993, 1994; Даев,Дукельская, 2004), а также вызывают иммуносупрессию (Даев, 2006). С другой стороны,ряд данных говорит о том, что физиологический стресс может дестабилизировать геномклеток (см. 1.2.2, 1.2.3).Было исследовано, может ли индуцировать геномную нестабильность в клеткахкостного мозга ещё один ольфакторный стрессор мышей – хемосигналы мочи кошки (МК)(рис.
24). Существует большое количество исследований, демонстрирующих, чтохемосигналы кошки вызывают у грызунов ярко аверсивный эффект (McGregor et al., 2002;Bowen et al., 2012; Xu et al., 2012), причем он даже более выражен, чем ответ на запахзмеи (de Oliveira Crisanto et al., 2015), крысы (Dent et al., 2014) и лисий феромон триметилтиазолин (ТМТ) в естественной концентрации (Hacquemand et al., 2013).Помимоповеденческих эффектов хемосигналы кошки индуцируют у мышей физиологическийстресс, что выражается в повышении секреции глюкокортикоидов, а также – активацииобластей гипоталамуса, ответственных за реакцию опасности (Roy et al., 2001; Sotnikov etal., 2011; Voznessenskaya, Malanina, 2013; de Oliveira Crisanto et al., 2015). Показано также,что хроническое предоставление МК индуцировало хромосомные перестройки вмейотически делящихся половых клетках хомячка Кэмпбелла (Vasilieva et al., 2000).
Приэтом влияние МК на стабильность генома клеток костного мозга мышей ранее не изучали.Показано, что 2-часовое предоставление хемосигналов МК приводило к увеличениюмикроповреждений ДНК: частоты поврежденных клеток и сильно поврежденных клеток в1,7 и 4,3 раза, соответственно (рис. 24, «В», «Г»). При этом 24-часовое предоставлениеМК, как и в случае с 24-часовым воздействием 2,5-ДМП, не приводило к увеличению120доли клеток с поврежденной ДНК, однако приводило к увлечению частоты делящихсяклеток с НМ в 1,6 раза (рис. 24, «А»).Интересно, что ольфакторные воздействия (как 2,5-ДМП, так и МК) вызывализначительно более слабые генотоксические эффекты, по сравнению с инъекциейхимического мутагена – акриламида, который являлся положительным контролем вэкспериментах по кометному электрофорезу (рис.
23, 24).Интересно рассмотреть взаимосвязь между уровнем микроповреждений ДНК(отношением частоты поврежденных клеток в «опыте» и «контроле») при 2-часовомольфакторном воздействии и уровнем НМ при 24-часовом воздействии. В случае 2,5-ДМП2,3-кратное увеличение частоты клеток с микроповреждениями ДНК (через 2 часа)приводило к 2,1-кратному увеличению частоты клеток с НМ (через 24 часа) (рис.
23, 21).АвслучаеМК1,7-кратное(болееслабое)увеличениечастотыклетоксмикроповреждениями ДНК (через 2 часа) приводило к 1,6-кратному (также болееслабому) увеличению частоты клеток с НМ (через 24 часа) (рис. 24).Наблюдаемыйпараллелизмвданныхполученнымметодомкометногоэлектрофореза и ана-телофазным методом, с одной стороны, могут свидетельствовать окорректности применяемых методов для выявления геномной нестабильности в клеткахкостного мозга.
С другой стороны, данные результаты демонстрируют, что, скорее всего,именно микроповреждения ДНК приводят к формированию хромосомных перестроек иувеличению частоты НМ.Показано также, что генотоксический эффект 2,5-ДМП, по-видимому, сильнееэффекта МК, что является косвенным свидетельством того, что 2,5-ДМП может бытьболее сильным стрессором для домовой мыши, чем МК.Другим классическим воздействием является иммобилизация мышей, считающаясясильным психо-социальным стрессором (Bowers et al., 2008).
Было проведено сравнениегенотоксического эффекта 2-часового воздействия 2,5-ДМП и иммобилизации на мышахлиний C3H и CBA (рис. 25, 27). Известно, что двух часов иммобилизации оказываетсядостаточно для развития стресса у мышей (Bowers et al., 2008; Spencer et al., 2012;Zimprich et al., 2014). После завершения воздействия забор материала осуществляли через22 часа, что объясняется применением для анализа ана-телофазного метода, для которогоранее было показано, что пик НМ происходил через 24 часа после начала воздействия(рис.
21).Осуществление иммобилизации всегда требует прямого контакта экспериментаторас животным для помещения мыши в иммобилизационную камеру, что являетсядополнительным стрессирующим фактором– хендлингом. Поскольку в наших121экспериментах присутствовали группы мышей, на которых осуществляли толькозапаховые воздействия 2,5-ДМП (без хендлинга), то на контрольных мышей хендлинг неосуществляли (но ставили на клетки капсулу с дистиллированной водой). В связи с этимгруппа, которую подвергали иммобилизации, испытывала, по сравнению с контролем,сочетанное действие стрессоров: хендлинга и иммобилизации.На мышах линии С3Н было показано, что 2-часовая иммобилизация приводила кдестабилизации генома клеток костного мозга, что выражалось в статистически значимомповышении частоты НМ в 1,7 раза, по сравнению с контролем (рис.
25, «А»). В своюочередь, 2-часовое воздействие 2,5-ДМП также приводило к достоверному повышениючастоты НМ в 1,8 раза. Данные были подтверждены на мышах линии СВА (рис. 27,детальнобудетописанониже).Полученныенамирезультатысогласуютсяслитературными данными о том, через сутки после 2-часовой иммобилизации происходитусиление геномной нестабильности в костном мозге самцов мышей, что выражается вувеличенном количестве микроядер (Malvandi et al., 2010).Интересно, что иммобилизация меняла спектр отдельных типов нарушений митоза,приводя к увеличению доли одиночных мостов и снижая долю множественныхперестроек (рис. 25, «Б»). При этом воздействие 2,5-ДМП не приводило к возникновениюстатистически значимых отличий от контроля в спектре отдельных НМ (рис.
25, «Б»).Данные различия в эффекте 2,5-ДМП и иммобилизации могут быть связаны с разныминейрональными и/или физиологическими механизмами, которые приводят к запускугенотоксического эффекта при данных воздействиях.То, что 2-часовое воздействие 2,5-ДМП приводило к увеличению частоты НМ через22 часа после завершения воздействия (рис. 25), говорит в пользу ранее выдвинутой намигипотезы, что в первые часы воздействия 2,5-ДМП возникают микроповреждения ДНК(которые выявляют кометным электрофорезом). Их ошибочная репарация приводит, в томчисле, и к формированию хромосомных перестроек, которые будут регистрироваться привступлении клетки в митоз, что может происходить и через сутки после началавоздействия.Таким образом, показано, что два классических стрессора мышей (воздействие МК ииммобилизация), также как и 2,5-ДМП, приводили к дестабилизации генома клетоккостного мозга у мышей различных линий, что выражалось как в повышении уровнямикроповреждений ДНК, так и в увеличении частоты НМ.Полученные данные представляют особый интерес в свете знаний о том, наскольковажную роль играет соматический мутагенез в функционировании костного мозга и всейгематопоэтической системы.122Так,былопродемонстрировано,чтосоматическиймутагенезприводиткнакоплению с возрастом геномных нарушений в ГСК (и, как следствие, в болеедифференцированных клетках крови и костного мозга), что, в свою очередь, приводитлибо к клеточной гибели, либо к дисфункциям (Welch et al., 2012; Goodell, Rando 2015).Уэлч с соавторамипродемонстрировал, чтоу человека вГСК, а также впредшественниках клеток крови (делящихся клетках костного мозга) происходитнеожиданно сильный мутагенез и накапливается около 10-ти новых соматическихмутаций на клетку в год (Welch et al., 2012; Goodell, Rando 2015).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
