Диссертация (1145717), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Такойанализпозволяетвыявитьмногиемакроповрежденияхромосом,втомчисленереципрокные транслокации, разорванные хромосомы, слипшиеся хромосомы (Даев идр., 2009; Aguilera, Garcia-Muse, 2013). Щелочной кометный электрофорез, напротив,позволяет выявить общий уровень микроповреждений ДНК, к которым относятся одно- идвунитевые разрывы, а также апуриновые и апиримидиновые сайты (Dhawan et al., 2009).Работу по выявлению геномных эффектов различных воздействий проводили восновном на мышах линии СВА. Данная высокоинбредная линия является классическойшироко используемой линией мышей, которую часто применяют в экспериментах поизучению стресса (Ichihara et al., 2009; Hall et al., 2012; Miranda, Roux, 2017) иольфакторных воздействий (Voznessenskaya et al., 2010; Ferrero et al., 2013). Ранее нашейнаучной группой на линии СВА был обнаружен ряд цитогенетических эффектов 2,5-ДМП(Даев, 2006;Даев и др., 2007, 2008, 2012). Так, было показано, что при 24-часовомвоздействии 2,5-ДМП индуцировал повышение частоты нарушений митозов (НМ) вклетках костного мозга самцов мышей (Даев, 2006; Даев и др., 2008).На первом этапе данной работы мы проверили способность 2,5-ДМП влиять настабильность генома мышей трех разных линий.
Было показано, что 24-часовоевоздействие приводило к статистически значимому повышению уровня НМ в клетках116костного мозга самцов мышей линии СВА, BALB/c и C3H (рис. 21, «А», рис. 22, «А», рис.25, «А»). Поскольку воздействие 2,5-ДМП повышало частоту НМ у различных линиймышей – можно предполагать, что данный кластогенный эффект феромона являетсянеспецифическим для домовой мыши. Это также подтверждается литературнымиданными о том, что воздействие 2,5-ДМП приводило к увеличению частоты НМ в клеткахкостного мозга самцов линий C57Bl, ICR, BALB/c и CBA (Даев, 2006; Даев и др., 2008).Кроме того, в результате проведенного литературного поиска нами не обнаружено ниодного исследования, в котором 24-часовое воздействие 2,5-ДМП не увеличивало бычастоту НМ в клетках костного мозга самцов какой-либо линии мышей.
Важно отметить,что в данной работе эффект 2,5-ДМП на индукцию геномной нестабильности в клеткахкостного мозга мышей линии С3Н был показан впервые.Поскольку 2,5-ДМП вызывал у самцов линии СВА более выраженный эффектдестабилизации генома (увеличение НМ в 2,1 раза, по сравнению с 1,8 раз у линийBALB/c и C3H) (рис. 21, «А», рис. 22, «А», рис. 25, «А»), большинство дальнейшихэкспериментов проводили только на мышах линии СВА. В последующих экспериментахпри 24-часовом воздействии 2,5-ДМП на самцов линии СВА, частота НМ в клеткахкостного мозга увеличивалась не менее чем в 2,1 раз, по сравнению с контролем (рис. 28,31).Интересно, что фоновый уровень НМ у изучаемых нами линий (СВА, BALB/c иC3H) различался.
Так, у самцов линии BALB/c он был в 2 раза выше, чем у самцов линииСВА и С3Н (рис. 21, «А», рис. 22, «А», рис. 25, «А»). Кроме того, спектр «спонтанных»НМ у животных линии С3Н отличался от спектра НМ линий СВА и ВАLB/с (рис. 21, «А»,рис. 22, «А», рис. 25, «А»). У мышей линии С3Н самым частым типом нарушенийявлялись множественные перестройки, в то время как у мышей линий СВА и BALB/c –это был редкий тип нарушений, а наиболее частым НМ являлись одиночные мосты. Повидимому,подобнаяспецификавнарушенияхработыхромосомногоаппаратаобъясняется индивидуальными характеристиками линий.
Обращает на себя тот факт, чтомножественные перестройки (характерные для линии C3H) являются более серьезнымигенетическими нарушениями, чем одиночные мосты и одиночные фрагменты (так каксостоят из нескольких одновременно произошедших одиночных нарушений).
Можнопредположить, что это вносит вклад в бо́льшую частоту возникновения онкологическихзаболеваний у мышей данной линии (Peraino et al., 1973).Кроме того, нами был изучено влияние длительности воздействия 2,5-ДМП наиндукцию НМ в клетках КМ самцов линии СВА (рис. 21, «А»). Исследовали 4-, 24- и 48часовое воздействие. Было обнаружено, что все три типа воздействия приводили к117увеличению частоты НМ, а пик НМ наблюдали при 24-часовом воздействии даннымхемосигналом (рис. 21, «А»).
При этом при воздействии в течение 2-х суток частота НМбыла ниже, чем при 24-часовом предоставлении 2,5-ДМП (рис. 21, «А»), что можетговорить о начале адаптации мышей к запаху. Например, известно, что длительноепредоставление мышам стрессирующего запаха хищника может приводить к адаптации иснижению концентрации стресс-гормонов до контрольных значений (Liu et al., 2017).Ана-телофазный тест на хромосомные аберрации, который использовали в даннойработе, выявляет геномную нестабильность, у которой могут быть различные причины.Например, на молекулярном уровне причинами формирования мостов может быть инедорепликация в S-фазе, и слипания теломер, и неправильная репарации одно- идвунитевых разрывов (Aguilera, Garcia-Muse, 2013).
Причем, учитывая, что нарушениямитоза заметны уже после 4-часового воздействия 2,5-ДМП, события, приводящие кхромосомным перестройкам должны происходить уже в первые 4 часа воздействия.На следующем этапе было изучено влияние длительности воздействия 2,5-ДМП (1,2, 4 и 24 часа) на индукцию микроповреждений ДНК в клетках КМ самцов CBA. Былопоказано, что 2-часовое воздействие приводило к увеличению частоты поврежденныхклеток в 2,3 раза, а 4-часовое – в 1,9 раза, в то время как 1-часовое и 24-часовоевоздействия частоту поврежденных клеток не повышали (рис.
23, «А»). Дополнительныйанализ сильно поврежденных клеток выявил, что только 2-часовое воздействие привело кдостоверному увеличению их частоты (в 2,6 раза) (рис. 23, «Б»).Таким образом, было выявлено, что пик микроповреждений ДНК в клетках костногомозга при действии 2,5-ДМП происходит через 2 часа воздействия (рис.
23). Это говорит отом,чтозапускаемые2,5-ДМПвнутриорганизменныепроцессы,приводящиеобразованию повреждений ДНК, протекают в течение первых 2-х часов. По-видимому,послеэтоговременирепарационныепроцессыначинаютпреобладатьнадповреждающими, поскольку к 4-м часам происходило снижение частоты сильноповреждённых клеток (их частота перестает отличаться от контроля), а к 24-м часамчастота клеток с поврежденной ДНК (в том числе и сильно поврежденной) полностьюпереставала отличаться от контрольных значений. С другой стороны, возможно, что попрошествии некоторого времени после начала воздействия 2,5-ДМП поврежденияперестают возникать.О роли репарационных механизмов в формировании ответной реакции на стрессможет говорить схожий эксперимент, в ходе которого мышей подвергали действиюдинамического стрессора (5-минутное плаванье в холодной воде) (Mikhailov, Vezhenkova,2007).
Это привело к повышению уровня двунитевых разрывов ДНК (выявляемых по118фокусам гистонов γH2AX) в кардиомиоцитах через час после воздействия и полномувосстановлению уровня повреждений до контрольного через 24 часа.ПредставляетмакроповрежденийособыйинтересДНК(методомсравнениеДНК-кометдинамикиивыявленияана-телофазныммикро-ианализом,соответственно) при действии 2,5-ДМП.
Если пик возникновения НМ при предоставленииданного хемосигнала приходился на 24 часа воздействия (рис. 21), то микроповреждения кэтому времени уже исчезали (рис. 23). Это может говорить о том, что микроповрежденияДНК начинают репарироваться в клетках, причем репарация с определённой частотойпроисходитошибочно,приводяквозникновениюхромосомныхнарушений(дицентрические хромосомы, бесцентромерные фрагменты хромосом), которые ивыявляет ана-телофазный тест.
Период времени, по прошествии которого можно выявитьувеличение частоты НМ, зависит от той фазы клеточного цикла, когда у клеткипроисходили повреждения ДНК. Можно предположить, что если повреждения ДНКвозникали в клетке в G2 фазе, то сразу после репарации (в том числе и неправильной) онамогла вступить в митоз, и в этом случае НМ могут быть зафиксированы уже черезнесколько часов после возникновения микроповреждений ДНК. Это подтверждаютданные, полученные в нашей работе, которые демонстрируют, что НМ в клетках костногомозга выявляли уже после 4-часового воздействия 2,5-ДМП (рис. 21). С другой стороны, вкостном мозге большая часть клеток находится в G1 (или G0) фазе, и НМ могутвыявляться у них с существенной задержкой, по сравнению со временем возникновениямикроповреждений ДНК. Среднее время клеточного цикла для клеток костного мозгасоставляет 23-24 часа (Meijer et al., 2012).
Это согласуется с полученными нами даннымио том, что пик НМ происходил именно при 24-часовом воздействии 2,5-ДМП (рис. 21).Кроме того, часть клеток может вступать в деление с ещё большей задержкой (например,покоящиеся стволовые клетки костного мозга). Это может являться одной из причин того,что НМ наблюдали в делящихся клетках и при 48-часовом предъявлении 2,5-ДМП (рис.21).Таким образом, показано, что воздействие 2,5-ДМП приводит к дестабилизациигенома в клетках костного мозга самцов мышей, выявляемой как методом щелочногокометного электрофореза, так и ана-телофазным методом учета хромосомных аберраций(нарушений митоза).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
