Диссертация (1145717), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Эксперимент 13. Исследование влияния хемосигналов самок-одиночек начастоту радиоиндуцированных нарушений митоза в клетках костного мозга самцовлинии СВАЦель эксперимента: проверить способность ХСО влиять на стабильность генома клетоккостного мозга самцов линии CBA при действии рентгеновского облучения.Эксперимент проводили с использованием 48 самцов и 20 самок (в качестве донорахемосигналов) мышей линии СВА.Воздействие осуществляли хемосигналами самок-одиночек (ХСО), подстилкукоторых собирали стандартным способном (см.
раздел 2.2.9.). В качестве контрольноговоздействия использовали чистую подстилку. При воздействии ХСО (или чистойподстилкой) опилки докладывали в клетку к самцам без высаживания мышей.Другим действующим фактором было тотальное облучение самцов мышейрентгеновскими лучами. Облучение производили на аппарате РУМ-11, фильтр (0,5 Cu + 1Al), напряжение на трубке – 180 кВ, мощность дозы 0,269 Гр/мин, доза 4 Гр.88Рис.
20. Схема эксперимента по определению влияния хемосигналов самок-одиночек(ХСО) на частоту возникновения радиоиндуцированных (4 Гр) нарушений митоза.Остальные пояснения в разделе «протокол эксперимента».Протокол эксперимента. Было проведено две повторности эксперимента. Мыши былиразделены на 3 экспериментальные группы, по 5-6 мышей каждая. Каждую группусодержали в отдельном помещении, не имеющем воздушного контакта с соседними.1) Мышей контрольной группы «К» помещали в установку для облучения, но прибор невключали.
После этого подстилку в клетке заменяли на чистую.2) В группе «4Гр» мышей подвергали рентгеновскому облучению в дозе 4 Гр, послекоторого половину подстилочного материала заменяли на свежие опилки.3) В группе «Рентген + ХС» мышей подвергали рентгеновскому облучению в дозе 4 Гр,после которого половину подстилки заменяли равным по объему количеством подстилкисамок-одиночек. В первой повторности эксперимента использовали 10 самцов, а во второй– 6.Замену половины подстилки в дни экспериментов осуществляли без высаживаниямышей из клеток. Все экспериментальные процедуры, связанные с перемещением мышейк установке для облучения, и прочие воздействия производили одинаково для всех группмышей с целью минимизации действия посторонних факторов.Животных забивали через 24 часа после начала воздействия методом цервикальнойдислокации.
Интервал между забоем животных разных групп составлял 20 мин. Дляпроведения ана-телофазного теста костный мозг фиксировали и шифровали согласностандартной процедуре (см. разделы 2.2.2., 2.2.3.).892.2.18. Статистическая обработкаПосле получения первичных данных и расшифровки собранных образцовстатистическуюобработкуначиналиспроверкиданныхнанормальностьвнутригруппового распределения (критерий Холмогорова-Смирнова или критерийШапиро-Уилка – в зависимости от количества особей в группе).
Весь статистическийанализ проводили в программе GraphPad Prism 5TM. В случае если распределение всехгрупп было нормальным, то для сравнения двух групп использовали t-критерийСтьюдента, а для сравнения более чем двух групп – критерий ANOVA с поправкойТьюки.Внутригрупповые результаты при ана-телофазном анализе также проверяли нагомогенность критерием χ2 (Глотов и др., 1982).
В случае отсутствия нормальноговнутригруппового распределения, но при внутригрупповой гомогенности, у всех группэксперимента данные внутри групп объединяли. Межгрупповые различия выявляли спомощью многопольного критерия χ2. Кроме того, критерий, χ2 использовали длясравнения спектров отдельных типов нарушений.В случае если внутригрупповое распределение было не нормальным и негомогенным, для сравнения данных двух групп использовали критерия Манна-Уитни, адля сравнения более чем двух групп – критерий Краскела-Уоллиса.
Различия считалидостоверными при уровне значимости p<0,05.Для оценки уровня оксигенации обонятельных луковиц производили обработкуполученных томографических изображений в пакете программ SPM8, бесплатномприложении MATLAB. Для оценки множественного сравнения средних использовалиLSD-тест. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.90ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ3.1. Эксперимент 1. Исследование влияния длительности воздействия 2,5-ДМП начастоту нарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии СВАДля изучения стабильности генома клеток костного мозга самцов мышей приразличном времени воздействия 2,5-ДМП был проведен эксперимент с тремя временнымиточками: 4 часа, 24 часа и 48 часов. Использовали ана-телофазный метод анализанарушениймитоза(методхромосомныхаберраций),позволяющийвыявитьцитогенетические нарушения при делении клетки: хромосомные мосты, фрагменты, атакже отставшие хромосомы.Результаты внутри всех групп были распределены нормально.
Полученные данныеобрабатывали методом множественных сравнений средних (ANOVA). Среднее значениеуровня нарушений митоза в контрольной группе составляли 2,2% (рис. 21, «А»).Воздействие 2,5-ДМП приводило к достоверному повышению уровня митотическихнарушений при каждом из изучаемых периодов воздействия.Рис.
21. (А) Частота нарушений митоза (M ± SE, %) в клетках костного мозга самцов CBAпри различной продолжительности воздействия 2,5-ДМП. По оси X – расположеныварианты воздействия: «К» – контроль, «ДМП4ч», «ДМП24ч» «ДМП48ч» – воздействие2,5-ДМП в течение 4, 24 и 48 часов, соответственно. Звездочками помечены достоверноразличающиеся группы («*» – p<0,05; «**» – p<0,01; «***» – p<0,001), критерий ANOVA.(Б) Спектры различных нарушений митоза, у контрольной группы и при действии 2,5ДМП.91При 4-часовом воздействии 2,5-ДМП наблюдали увеличение уровня нарушениймитоза в 1,7 раза до 3,8% (p<0,001); при 24-часовом воздействии – в 2,1 раза (p<0,001) до4,6%, а при 48-часовом воздействии – в 1,6 раз до 3,6% (p<0,01). При этом наблюдалидостоверное снижение эффекта 2,5-ДМП при 48-часовом воздействии, по сравнению с 24часовым (p<0,05) (рис. 21, «А»).
При всех вариантах воздействий спектр типов перестроекбыл неотличим от контрольного (рис. 21, «Б»). Основную долю нарушений составлялиодиночные мосты и фрагменты.Таким образом, было показано, что 2,5-ДМП увеличивает частоту нарушениймитозов в клетках костного мозга самцов линии CBA при 4-часовом, 24-часовом, а также– 48-часовом воздействии. При этом требовалось проверить, не является ли такой эффектспецифическим ответом животных линии СВА или характерен и для мышей другихлиний.3.2. Эксперимент 2. Исследование влияния 2,5-ДМП на частоту нарушений митоза вклетках костного мозга самцов линии BALB/cЭффект дестабилизации хромосомного аппарата делящихся клеток костного мозгапри 24-часовом воздействии 2,5-ДМП был показан также на самцах другой линии –BALB/c (рис.
22). Длительность воздействия (24 часа) была выбрана как оптимальная наоснове данных предыдущего эксперимента.Рис. 22. (А) Изменение частоты нарушений митоза (M ± SE, %) в клетках костного мозгасамцов BALB/c при 24-часовом воздействии 2,5-ДМП – «ДМП24ч»; контроль – «К».
Награфике сверху указан уровень значимости, t-критерий. (Б) Спектры различныхнарушений митоза, у контрольной группы и при действии 2,5-ДМП.92Средний уровень нарушений митоза при действии 2,5-ДМП составил 11,2% и был в1,8 раза (p<0,0001) выше контрольного (6,2%) (рис. 22, «А»). Различий в спектреперестроек выявлено не было, основным типом нарушений был одиночный мост (рис. 22,«Б»).Таким образом, эффект дестабилизации генома в результате воздействия 2,5-ДМПвыявили и у самцов мышей линии BALB/c. При этом оставалось неясным, может ли бытьвыявленэффектдестабилизациигеноманетольконахромосомномуровне(макроповреждения), но и на уровне микроповреждений ДНК.3.3.
Эксперимент 3. Исследование влияния 2,5-ДМП на частоту повреждений геномав клетках костного мозга самцов линии СВА, выявляемых методом кометногоэлектрофорезаОценка количества клеток с поврежденной ДНК (доля ДНК в хвосте кометы более5%), выявляемых методом щелочного кометного электрофореза, показала, что данныевнутри каждой из групп распределены нормально. Средняя частота поврежденных клетокв контрольной группе составляла 19,8% (рис. 23, «А»).
Через час после началавоздействия 2,5-ДМП частота поврежденных клеток составила 30,3% (что не отличаетсяот контроля из-за разброса данных), через 2 часа – 45,6% (отличия от контролядостоверны, p<0,001), через 4 часа – 38,3% (отличия от контроля достоверны, p<0,001).При 24-часовом воздействии 2,5-ДМП частота поврежденных клеток составила 18,4%, чтоне отличалось от контрольных значений, и было достоверно ниже групп «ДМП 2 часа»(p<0,01) и «ДМП 4 часа» (p<0,05).При анализе частоты сильно повреждённых клеток (содержание ДНК в хвостекометы больше 20%) данные некоторых групп были распределены не нормально, поэтомудля сравнения использовали критерий Краскела-Уоллиса.
Достоверные отличия былиобнаружены только между группой «ДМП 2 часа» (13,9% сильно поврежденных клеток) и«Контролем» (5,3%) (p<0,01). Средняя частота сильно поврежденных клеток привоздействии 2,5-ДМП в течение 1 часа, 4 часов и 24 часов составляли 8,2%; 11% и 3,8%,соответственно.При этом количество поврежденных клеток любой группы были достоверно нижеколичества поврежденных клеток в случае «позитивного контроля» – акриламида «АКР»(Рис. 23).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
