Диссертация (1145717), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Прямой контактчеловека с мышью исключали, с целью максимального снижения стрессированияживотных вследствие «хэндлинга».Послезавершениявоздействияживотныхзабивалиметодомцервикальнойдислокации. Интервал между забоем животных разных групп составлял 20 мин.
Дляпроведения ана-телофазного теста костный мозг фиксировали и шифровали согласностандартной процедуре (см. разделы 2.2.2., 2.2.3.).2.2.14. Эксперимент 10. Исследование влияния феромона 2,5-ДМП и хемосигналовсамок-одиночек, а также сочетанного действия этих хемосигналов на активациюобонятельных луковиц самцов мышей линии BALB/cЦель эксперимента: изучить влияние хемосигналов 2,5-ДМП и ХСО, а также ихсочетанного действия, на активацию нейронов главных обонятельных луковиц самцовлинии BALB/c.Эксперимент проводили с использованием 15 самцов и 9 самок (донорыхемосигналов) линии BALB/c.
Возраст животных составлял 2 месяца.Воздействие осуществляли хемосигналами самок-одиночек (ХСО), подстилкукоторых собирали стандартным способном (см. раздел 2.2.9.).Другим действующим фактором был 0,01%-ный водный раствор 2,5-ДМП (Aldrich,97%).Исследованиепроводилиметодомфункциональноймагнитно-резонанснойтомографии (фМРТ) с помощью 11,7 Т томографа Biospec (Bruker, Германия) с диаметром82входного отверстия 110 мм, градиентной системой B-GA 6S-100 с "теплыми" шиммами иисточниками питания (амплитуда градиента 1 Т).Запаховый стимул предоставляли с помощью ольфактометра, разработанногоОтделом генофондов экспериментальных животных на базе ЦКП «SPF-виварий» ИЦиГСО РАН.
Данный прибор позволяет изменять и измерять скорость воздушного потока,предоставляемого животному в процессе эксперимента.Рис. 17. Схема эксперимента по изучению активации обонятельных луковиц прираздельном или сочетанном воздействии 2,5-ДМП и хемосигналов самок-одиночек (ХСО).На рисунке представлена последовательность предоставления запаховых стимулов. Всегодля одной мыши регистрировали 136 точек измерения. Томограммы, сделанные во времявдыханиявоздуха,являютсяконтролем ктомограммам,сделаннымвовремяпредоставления стимула. Остальные пояснения в разделе «протокол эксперимента».Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 3 экспериментальные группы, по 5самцов в каждой. Одному животному предъявляли только один вид запаха. Запаховыестимулы обновляли после каждого предъявления. Перед началом эксперимента животноенаркотизировали, в качестве наркоза использовали уретан (Sigma-Aldrich, 75 мг/кг).1) Каждой мыши из группы «ДМП» предоставляли запах 2,5-ДМП, наносив 50 мкл 0,01%раствора на фильтровальную бумагу (5х30 мм).
Смоченную фильтровальную бумагупомещали в ольфактометр со скоростью подачи воздуха 20 – 25 мл/мин.2) Каждой мыши из группы «ХСО» предоставляли запах смеси загрязненных подстилок 9ти самок-одиночек. Подстилку помещали в одноразовый пластиковый наконечник (1 мл)для автоматического дозатора, который присоединяли к офльфактометру со скоростьюподачи воздуха 20-25 мл/мин.833) Для каждой мыши из группы «ДМП+ХСО» в ольфактометр одновременно размещали иполоску фильтровальной бумаги смоченной 50 мкл 0,01% раствора 2,5ДМП иодноразовый пластиковый наконечник (1 мл), наполненный подстилкой самок-одиночек.Животным попеременно предъявляли исследуемый хемосигнал и чистый воздух,который являлся контролем, по схеме (рис.
17): первые 3 минуты – чистый воздух, далее5 раз подряд комбинацию: 1,5 мин. стимул, далее – 3 мин. чистый воздух. На каждоеживотное получали по 136 томограмм, из которых 40 были сняты при действии стимула, и96 – при действии чистого воздуха.Периодотсутствияподачизапаха(присменестимулов)реализовывалипринудительно за счет включения дополнительного насоса, осуществляющего сбросвоздуха, несущего запаховый стимул, в атмосферу в большем объеме, чем основной поток(30 – 35 мл/мин).Рис. 18. Обонятельная луковица самца мыши на типичном слайде фМРТ.Функциональную МРТ снимали, используя радиочастотную последовательность,основанную на Т2*-взвешенных градиент-эхо изображениях (EPI, TR/TE=60/6.8,84FOV=2.5x2.5 мм, толщина среза (slice thickness) = 1.5 мм, матрица (matrix) = 128x128)(рис.
18). Предварительно для каждого среза настраивали шиммирующую катушку,используя приложение Paravision 5.0 – Fastmap.Анализ изображений и настройку магнитной катушки производили сотрудникиОтдела генофондов экспериментальных животных базе ЦКП «SPF-виварий» ИЦиГ СОРАН. При анализе изображений оценивали амплитуду изменения уровня оксигенацииткани при предъявлении запахового стимула по изменению яркости зон обонятельныхлуковиц.2.2.15. Эксперимент 11. Исследование роли обонятельного эпителия вцитогенетических эффектах феромона 2,5-ДМП и хемосигналов самок-одиночек настабильность хромосомного аппарата клеток костного мозга самцов мышей линииСВАЦель эксперимента: исследовать влияние инактивации всех обонятельных зон настабильность генома клеток костного мозга самцов CBA при воздействии 2,5-ДМП иХСО.Эксперимент проводили с использованием 26 самцов и 10 самок (донорыхемосигналов) линии СВА.
Возраст животных составлял 2 месяца.За десять дней до начала эксперимента самок рассадили поодиночке, за 5 дней доначала эксперимента осуществляли замену подстилки на чистую. Перед началомэксперимента у всех самок была собрана моча. В дальнейшем её использовали какисточник хемосигналов самок-одиночек (ХСО).Мочу самок собирали с помощью легкого массажа брюшной части тела животного,удерживаемого над чашкой Петри. Затем образцы мочи от всех самок объединяли в однупробирку, которую хранили при -70 °С.
Непосредственно перед началом воздействиямочу самок размораживали. Для воздействия ХСО на решетке клеток с самцамиразмещали перфорированную капсулу, содержащую фильтровальную бумагу с 100 мклмочи самок, смешанными с 400 мкл дистиллированной воды.Другим действующим хемосигналом являлся 0,01% водный раствор 2,5-ДМП (0,5мл), предоставляемый по стандартной методике (см. раздел 2.2.2).Вкачествеконтрольноговоздействияиспользоваликапсулу,содержащуюфильтровальную бумагу с 0,5 мл дистиллированной воды.Для инактивации обонятельного эпителия использовали метод интраназальногозакапывания 100 мкл 10% сульфата цинка (по 50 мкл в каждую ноздрю).
Контролем к85закапыванию сульфата цинка было закапывание в нос физиологического раствора. Послезакапывания в нос, мыши проходили 3-дневную адаптацию, после которой на мышейвоздействовали хемосигналами.Рис. 19. Схема эксперимента по изучению цитогенетических эффектов от воздействия 2,5ДМП или хемосигналов самок-одиночек (ХСО), при предварительном закапывании в носсульфата цинка.
«N жив.» – количество животных в группе. Остальные пояснения в разделе«протокол эксперимента».Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 6 экспериментальных групп, по 5 –6 животных в каждой. Мышей содержали в индивидуально вентилируемых клетках.1) Контрольной группе «K» за три дня до начала воздействий закапывали в носфизиологический раствор, а в день начала запаховых воздействий на клетку располагаликапсулу, содержащую фильтровальную бумагу с дистиллированной водой.2) Мышам группы «Zn K» за три дня до начала воздействий закапывали в нос сульфатцинка. В день начала запаховых воздействий на клетку располагали капсулу, содержащуюфильтровальную бумагу с дистиллированной водой.863) Мышам группы «ДМП» за три дня до начала воздействий закапывали в носфизиологический раствор. В день эксперимента на клетку располагали капсулу сраствором 2,5-ДМП.4) Мышам группы «Zn ДМП» за три дня до начала воздействий закапывали в нос сульфатцинка.
В день начала запаховых воздействий на клетку располагали капсулу с раствором2,5-ДМП.5) Группе «ХСО» за три дня до начала за три дня до начала воздействий закапывали в носфизиологический раствор. В день начала запаховых воздействий на клетку располагаликапсулу с раствором мочи самок-одиночек.6) Группе «Zn ХСО» за три дня до начала воздействий закапывали в нос сульфат цинка. Вдень начала запаховых воздействий на клетку располагали капсулу с раствором мочисамок-одиночек.Животных забивали через 24 часа после начала воздействия методом цервикальнойдислокации. Интервал между забоем животных разных групп составлял 20 мин.
Дляпроведения ана-телофазного теста костный мозг фиксировали и шифровали согласностандартной процедуре (см. разделы 2.2.2., 2.2.3.).2.2.16. Эксперимент 12. Исследование влияния хемосигналов самок-одиночек начастоту спонтанных нарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии СВАЦель эксперимента: дополнительно проверить способность ХСО влиять на стабильностьгенома клеток костного мозга самцов линии CBA в отсутствие внешних мутагенныхвоздействий.Эксперимент проводили с использованием 11 самцов и 10 самок (в качестве донорахемосигналов) мышей линии СВА.Воздействие осуществляли хемосигналами самок-одиночек (ХСО), подстилкукоторых собирали стандартным способном (см. раздел 2.2.9.).
В качестве контрольноговоздействия использовали чистую подстилку. При воздействии ХСО (или чистойподстилкой) опилки докладывали в клетку к самцам без высаживания мышей.Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 2 экспериментальные группы.Каждую группу содержали в отдельном помещении без воздушного контакта с соседнимпомещением.871) Первой группе (5 мышей) заменяли подстилку на загрязненную 10 самкамиодиночками.2) Вторая группа (6 мышей) была контрольной.
Мышам заменяли подстилку на чистую.Замену подстилки осуществляли без высаживания мышей из клеток, поэтомузаменяли только половину подстилочного материала. Прямой контакт человека с мышьюисключали, с целью максимального снижения стрессирования животных вследствие«хэндлинга».Животных забивали через 24 часа после начала воздействия методом цервикальнойдислокации. Интервал между забоем животных разных групп составлял 20 мин. Дляпроведения ана-телофазного теста костный мозг фиксировали и шифровали согласностандартной процедуре (см. разделы 2.2.2., 2.2.3.).2.2.17.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
