Диссертация (1145717), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Интервал между забоем животных разных групп составлял 20 мин.Для проведения ана-телофазного теста костный мозг фиксировали и шифровалисогласно стандартной процедуре (см. разделы 2.2.2., 2.2.3.).712.2.9. Эксперимент 6. Исследование влияния 2,5-ДМП и хемосигналов самокодиночек на изменение концентрации гормонов в крови самцов линии СВАЦель эксперимента: исследовать влияние воздействия различных типов хемосигналовсамок: 2,5-ДМП и хемосигналов самок-одиночек – на уровень кортикостерона,тестостерона, окситоцина и лютеинизирующего гормона в плазме периферической кровисамцов линии CBA.Эксперимент проводили с использованием 58 самцов и 10 самок (донорыхемосигналов) линии СВА. Возраст животных составлял 2 месяца.Стандартная процедура сбора хемосигналов самок-одиночек (ХСО).За 10 дней до начала эксперимента самок рассадили поодиночке, за 5 дней до началаэксперимента осуществляли замену подстилки на чистую.
Перед началом эксперимента увсех самок была взята загрязненная подстилка и тщательно перемешена. В дальнейшем еёиспользовали как источник хемосигналов самок-одиночек (ХСО).Другим действующим фактором был 0,01% водный раствор 2,5-ДМП (1,5 мл),предоставляемый по стандартной методике (см. раздел 2.2.2).Рис. 13. Схема эксперимента по изучению гуморального ответа самцов мышей напредоставление 2,5-ДМП и хемосигналов самок-одиночек. «N жив.» – количество животныхв группе. Остальные пояснения в разделе «протокол эксперимента».72Протокол эксперимента. Самцов мышей содержали в группах.
Для выравниванияусловий воздействия за 2 дня до начала эксперимента все самцы были рассаженыпоодиночке в индивидуально вентилируемые клетки с крышками, блокирующимипоступление внешних запахов. Во время эксперимента на каждую мышь осуществлялииндивидуальное воздействие с точностью замера длительности воздействия ±1 минута.Воздействия осуществляли в дневное время.1) Первый тип воздействия являлся контрольным (вариант «H2O»). Двенадцати самцам нарешетку клеток размещали перфорированные капсулы, содержащие дистиллированнуюводу, а в клетку добавляли чистую подстилку.
Длительность воздействия для 6-ти самцовсоставляла 30 минут, а для остальных 6-ти самцов – 60 минут.2) Вторым типом воздействия являлось предоставление 2,5-ДМП (вариант «ДМП»).Шестнадцати самцам нарешетку клеток размещали перфорированные капсулы,содержащие раствор 2,5-ДМП, а в клетку добавляли чистую подстилку. Длительностьвоздействия для 8-ми самцов составляла 30 минут, а для остальных 8-ми самцов – 60минут.3) Третьим типом воздействия являлось предоставление хемосигналов самок-одиночек(вариант «ХСО»). Четырнадцати самцам на решетку клеток размещали перфорированныекапсулы, содержащие дистиллированную воду, а в клетку добавляли подстилку самокодиночек. Длительность воздействия для 7-ми самцов составляла 30 минут, а дляостальных 7-ми самцов – 60 минут.4) Четвертым типом воздействия являлось совместное действие 2,5-ДМП и хемосигналовсамок-одиночек. Шестнадцати самцам решетку клеток размещали перфорированныекапсулы, содержащие раствор 2,5-ДМП, а в клетку добавляли подстилку самок-одиночек.Длительность воздействия для 8-ми самцов составляла 30 минут, а для остальных 8-мисамцов – 60 минут.После завершения воздействия у мышей брали образцы крови из ретроорбитальногосинуса в обработанные гепарином пробирки, а затем умерщвляли их методомдекапитации и брали дополнительно высвободившуюся кровь.
На взятие пробы кровизатрачивали не более двух минут, что позволяло избежать стрессирующего влиянияманипуляций на уровень изучаемых гормонов. Образцы крови центрифугировали (3000об/мин, 15 мин при +4° С), плазму собирали, распределяли по микропробиркам (по 50мкл) и хранили при температуре -70 °С до определения концентрации кортикостерона,тестостерона, окситоцина и лютеинизирующего гормона.732.2.10. Определение концентрации гормонов в плазме кровиКонцентрацию кортикостерона, окситоцина и тестостерона определяли методомтвердофазногоИФА,основанногонаконкурентномсвязываниигормоновспецифическими антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок.Концентрацию лютеинизирующего гормона определяли методом твердофазногоИФА,основанногонанеконкурентномсвязываниигормоновспецифическимиантителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок.Для определения концентрации кортикостерона использовали набор «MouseCorticosterone (CORT) ELISA Kit» производства компании Cusabio, согласно приложеннойинструкции.Для определения концентрации окситоцина использовали набор «Mouse Oxytocin(OT) ELISA Kit» производства компании Cusabio, согласно приложенной инструкции.Для определения концентрации тестостерона использовали набор «СтероидИФАтестостерон» производства ЗАО «Алкор Био», согласно приложенной инструкции.Для определения концентрации лютеинизирующего гормона использовали набор«Mouse Luteinizing Hormone (LH) ELISA Kit» производства компании Cusabio, согласноприложенной инструкции.Анализ концентрации каждого гормона проводили отдельно.
Предварительно длякаждого набора тестировали, соответствует ли концентрация гормона в пробах диапазонуконцентраций, измеряемых набором. В случае необходимости производили разбавлениепроб до подходящей концентрации. Диапазон измерения концентрации в наборекортикостерона составлял 0,1-20 нг/мл; окситоцина – 0,5-200 мклМЕ/мл; тестостерона –0,2-50 нМоль/л; лютеинизирующего гормона – 2-75 млМЕ/мл.В начале процедуры анализа раствор плазмы размораживали при +4 °С и аккуратноперемешивали содержимое пробирок.Готовили рамку с нужным количеством стрипов.
В лунки вносили по 50 мклисследуемой плазмы или стандартов производителя (для построения калибровочнойкривой).Затем для измерения кортикостерона и окситоцина в лунки добавляли 50 мклпероксидазного конъюгата и 50 мкл антител. Стрипы инкубировали при температуре+37°С при встряхивании на шейкере в течение 1 часа.
По окончании инкубации лункипромывали три раза автоматическим промывателем Wellwash (Thermo Fisher Scientific,USA), добавляя при каждой промывке по 250 мкл промывочного буфера в каждую лунку.74После промывки планшета остатки раствора удаляли декантированием (постукиваниемрамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге). Немедленновносили во все лунки по 50 мкл «раствора А» и 50 мкл «раствора Б». Далее стрипыинкубировали при температуре +37 °С в темноте в течение 15 минут. Затем добавляли вовсе лунки по 50 мкл стоп-реагента для остановки ферментативной реакции и встряхивалина шейкере в течение 1-2 мин. Оптическую плотность раствора в лунках измеряли нафотометре вертикального сканирования iMarkTM (BioRAD Laboratories, Inc) при длиневолны 450 нм.Для измерения тестостерона во все лунки добавляли по 150 мкл рабочего раствораконъюгата тестостерон-пероксидазы.
Стрипы инкубировали при комнатной температуре(от +18 до +25 °С) при встряхивании на шейкере в течение 1,5 часов. По окончанииинкубации лунки промывали три раза автоматическим промывателем Wellwash (ThermoFisher Scientific, USA), добавляя при каждой промывке по 300 мкл промывочного буфера вкаждую лунку. После промывки планшета остатки раствора удаляли декантированием(постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальнойбумаге). Немедленно вносили во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина иинкубировали стрипы при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут.
Затемдобавляли во все лунки по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментативной реакциии встряхивали на шейкере в течение 1-2 мин. Оптическую плотность раствора в лункахизмеряли на фотометре вертикального сканирования iMarkTM (BioRAD Laboratories, Inc)при длине волны 450 нм.Дляизмерениялютеинизирующегогормонавлункидобавляли50мклпероксидазного конъюгата. Стрипы инкубировали при температуре +37 °С привстряхивании на шейкере в течение 1 часа. По окончании инкубации лунки промывалитри раза автоматическим промывателем Wellwash (Thermo Fisher Scientific, USA),добавляя при каждой промывке по 250 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Послепромывки планшета остатки раствора удаляли декантированием (постукиванием рамки сострипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге).
Немедленно вносили вовсе лунки по 50 мкл «раствора А» и 50 мкл «раствора Б». Далее стрипы инкубировали притемпературе +37 °С в темноте в течение 15-ти минут. Затем добавляли во все лунки по 50мкл стоп-реагента для остановки ферментативной реакции и встряхивали на шейкере втечение 1-2 мин.
Оптическую плотность раствора в лунках измеряли на фотометревертикального сканирования iMarkTM (BioRAD Laboratories, Inc) при длине волны 450нм.752.2.11. Эксперимент 7. Исследование роли глюкокортикоидных гормонов вцитогенетических эффектах на клетках костного мозга самцов линии СВА придействии 2,5-ДМП и иммобилизацииЦель эксперимента: исследовать влияние блокатора синтеза глюкокортикоидов –метирапона – на генотоксические эффекты 2,5-ДМП и иммобилизации у самцов линииCBA.Эксперимент проводили с использованием 30 самцов мышей линии СВА. Данныйэксперимент проводили параллельно с Экспериментом 8 (см.
пункт 2.2.12.).Рис. 14. Схема эксперимента по изучению роли глюкокортикоидных гормонов ввозникновении генотоксических эффектов при действии 2,5-ДМП и иммобилизации.«N жив.» – количество животных в группе. Остальные пояснения в тексте.За 30 минут до начала воздействий 15-ти мышам внутрибрюшинно инъецировали150 мкл физиологического раствора, содержащего метирапон (Sigma-Aldrich) из расчета30 мг/кг (по Filaretova et al., 2012). Данное вещество блокирует синтез глюкокортикоидов,за счет обратимого ингибирования 11-β-Гидроксилазы (CYP11B1) (Young et al., 2007). Длявыравнивания условий эксперимента остальным 15-ти мышам вводили 150 мклфизиологического раствора.76В качестве хемосигнала использовали 0,01% водный раствор 2,5-ДМП (1,5 мл),предоставляемый по стандартной методике (см. раздел 2.2.2).Другимвоздействиемявляласьдвухчасоваяиммобилизация,проводимаястандартным способом (см.
Эксперимент 5, пункт 2.2.8.).В качестве контроля использовали мышей, которые свободно передвигались вклетке. При этом на решетку клетки помещали капсулу с фильтровальной бумагой,содержащей дистиллированную воду.Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 6 экспериментальных групп, по 5мышей каждая. Каждая группа находилась в отдельном помещении и не имелавоздушного контакта с соседними.1) Контрольной группе «К» инъецировали внутрибрюшинно 150 мкл физиологическогораствора, а через 30 минут на клетку размещали капсулу, содержащую фильтровальнуюбумагу с 1,5 мл дистиллированной воды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
