Диссертация (1145717), страница 14
Текст из файла (страница 14)
6, «А»)(Drickamer, 1982, 1988).При смешивании мочи, ускоряющей созревание (моча самцов или моча самок вэструсе, или моча беременных самок, или моча кормящих самок) и замедляющейсозревание (моча сгруппированных самок) в равном соотношении – у молодых самокреципиентов происходила задержка входа в первый эструс (Drickamer, 1982). Присмешивании мочи, ускоряющей и замедляющей созревание, в соотношении 4:1 и 7:1время входа в первый эструс не отличалось от контрольного, а при соотношении мочибольше чем 10:1 время входа самок-реципиентов в первый эструс сокращалось(Drickamer, 1988). Таким образом, было показано, что изменение количественного составаферомональной смеси может градиентно менять наблюдаемый эффект.54Рис.
6. Эксперименты, в которых были выявлены балансовые взаимовлияния феромонов.(А) (по Drickamer, 1982, 1988) Влияние смесей мочи самок во время беременности,кормленияиэструса,мочисамцов(мочи,ускоряющейсозревание)имочисгруппированных самок в различных соотношениях; (Б) (по Jemiolo et al., 1989) Влияниесмесей синтетически синтезированных феромонов на созревание молодых самок. Былиизучены влияния смеси 2-гексанона, 2-гептанона и 4-гептанона; смеси транс-4-гептен-2она и транс-5-гептен-2-она; смеси n-пентилацетата и 2-пентенилацетата и 2,5-ДМП, а также их комбинаций.55Также был проведен эксперимент по изучению воздействия смесей основныхидентифицированных компонентов мочи самок на время созревания молодых особей (рис.6, «А») (Jemiolo et al., 1989).
Было обнаружено, что смесь из двух кетонов,экскретируемых с мочой (транс-4-гептен-2-она и транс-5-гептен-2-она) способнаувеличивать продолжительность эструса относительно длинны всего цикла, но не влияетна время созревания молодых самок. Смесь из трех других кетонов (2-гексанон, 2гептанон, 4-гептанон) была способна не только удлинять эструс у половозрелыхживотных, но и ускорять созревание молодых самок. При этом смесь трех адреналзависимых феромонов (2,5-ДМП, n-пентилацетат и 2-пентенилацетат) вызывала обратныйэффект – замедление созревания молодых самок (происходила задержка входа в первыйэструс на 2 дня, по сравнению с контролем) и сокращение продолжительности эструса, посравнению с остальными стадиями цикла.
В данной работе впервые были протестированыэффекты смесей известных феромонов, противоположных по индуцируемым эффектам.Так, при добавлении транс-4(и 5)-гептен-2-онов к замедляющим созревание феромонам(2,5-ДМП и два ацетата) время входа в первый эструс молодых самок-реципиентовсохраняло эффект замедления на 2 дня. В свою очередь, при воздействии смесью из всех8-ми феромонов происходила полная нейтрализация эффекта замедления созревания и,более того, время входа в первый эструс сократилось на 2,5 дня, по сравнению сконтролем (вода), и стало таким же, как при воздействии позитивным контролем – мочойбеременных и кормящих самок (Jemiolo et al., 1989).Таким образом, была выявлена возможность модифицировать негативные эффекты2,5-ДМП другими феромонами, которые были выявлены в моче самок, находящихся вэструсе.
При этом оставалось неясным, могут ли другие запаховые сигналымодифицировать генетические эффекты 2,5-ДМП.Как было показано выше, усиление генетической нестабильности в случаевоздействия 2,5-ДМП, по-видимому, вызвано активацией нервной системы, однакоконкретные нейро-гуморальные пути, через которые осуществляются эффекты 2,5-ДМП,не выяснены. Несмотря на то, что выделение 2,5-ДМП находится под контролемнадпочечников, остается непонятным, индуцирует ли он в организме мышей-реципиентовстресс-реакцию.56ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ2.1. МатериалВ работе использовали лабораторных мышей трех высокоинбредных линий: CBA,С3НиBALB/с.Данныелиниихорошоохарактеризованывмногочисленныхисследованиях по цитогенетическим, поведенческим и иммунологическим признакам.Выбор мышей линии CBA был обусловлен тем, что большинство предварительныхданных об эффектах 2,5-ДМП (иммунологических, цитогенетических и поведенческих)были получены в нашей лаборатории на мышах данной линии (Даев и др., 2001; Даев,2003, 2006). Линия C3H является близкородственной к линии CBA, но при этомхарактеризуется высокой частотой опухолеобразования (Peraino et al., 1973).
Учитывая то,что генетическая нестабильность играет важную роль в малигнизации клеток, мы хотелиоценить специфичность реакции мышей данной линии на стрессирующие воздействия.Линия BALB/c является одной из наиболее часто используемых линий в лабораторныхэкспериментах и одновременно – сильно отличается от линий CBA и C3H поиммунологическим и физиологическим характеристикам (Shanks et al., 1991). Даннаялиния была выбрана для экспериментов, чтобы изучить эффекты хемосигналов на мышахдругой, неродственной линии.
Животных получали из питомника лабораторныхживотных «Рапполово». После получения из мышей формировали группы по 3-6 особей.Перед началом экспериментов мышей не менее 10 дней выдерживали в условиях виварияСПбГУ для адаптации. Животных содержали в пластиковых клетках размером 22×30×10см. при естественном световом дне, стандартном пищевом рационе и воде ad libitum.
Вкачестве подстилки использовали опилки.Некоторые эксперименты проводили на базе SPF-вивария Института цитологии игенетики СО РАН. В этом случае использовали местных мышей, выведенных в SPFвиварии, которых содержали в «чистых» условиях, в среде без патогенов. Мышейсодержали в индивидуально вентилируемых клетках (IVC, Tecniplast, Италия) по 4-6особей, при свободном доступе к воде и гранулированному корму для мышей («Чара»,Сергиев Посад), искусственном фотопериоде 12С:12Т (свет выключали в 17:00 ч местноговремени), температуре 22-24 ˚С и влажности 40-50%. В качестве подстилочного материалаиспользовалиберезовыегранулы,которыебылипредварительнопросушены,освобождены от пылевых фракций производителем (ООО «Альбион», Новосибирск).Кормиподстилочныйматериалпоступаликживотнымпослестерилизацииавтоклавированием при 121 ˚С.57Если в рамках эксперимента требовался сбор хемосигналов самок-одиночек (ХСО),то самок – доноров хемосигналов рассаживали поодиночке в стандартных клетках, вотдельном, изолированном от запаха самцов помещении.
Сбор хемосигналов (мочи илиподстилки) осуществляли не менее чем через неделю после индивидуальногорассаживания.Всего в работе было использовано 404 самца и 79 самок домовой мыши.2.2. Методы2.2.1. Схема экспериментовРабота была выполнена на базе Лаборатории генетики животных кафедры генетикии биотехнологии биологического факультета СПбГУ, при этом несколько экспериментовпровели в SPF-виварии Института цитологии и генетики СО РАН.В ходе исследования по теме диссертационной работы было проведено 13экспериментов. Общий план экспериментов представлен на рис.
7. Первым этапомисследования (эксперименты 1-5) была проверка различных стрессорных воздействий навозможность дестабилизировать геном клеток костного мозга самцов мышей разныхлиний (CBA, C3H, BALB/c) при кратковременном воздействии – от 1 часа до 48 часов. Ктаким воздействиям относились иммобилизация, предоставление хемосигналов мочидомашней кошки (Felis catus L.) или феромона самок мышей 2,5-диметилпиразина (2,5ДМП), выделяемого ими только в условиях переуплотненного содержания. Следующимэтапом исследований (эксперимент 6) являлось выявление гормонального ответа самцовмышей на предоставление 2,5-ДМП. Дополнительным контролем в данном экспериментебыло воздействие хемосигналов самок, которых содержали поодиночке и которые неиспытывали стресса от переуплотненного содержания. Исследуемыми гормонамиявлялись стресс-гормон кортикостерон, а также гормоны, связанные с репродуктивнымифункциями: тестостерон, лютеинизирующий гормон и окситоцин.
Кроме того, былаизучена роль стресс-гормонов (глюкокортикоидов и катехоламинов) в генотоксическомэффекте стресса (эксперименты 7, 8). Для этого на самцов мышей воздействовалифармакологическимблокаторомсинтезаглюкокортикоидов(метирапоном)илиблокатором β2-адренорецепторов (пропранололом), а затем исследовали наличиегенотоксических эффектов при иммобилизационном стрессе и воздействии 2,5-ДМП.58Данныеэтапыработыбылипризваныизучитьмеханизмывлиянияфизиологического стресса на стабильность генома соматических клеток организма (рис. 7,обведено красным).Рис. 7. Общий план экспериментов работы.
Стрелками указана последовательностьпроведения экспериментов. ХСО – хемосигналы самок-одиночек; 2,5-ДМП – 2,5диметилпиразин. Пояснения в тексте.На следующем этапе была изучена возможность препятствовать возникновениюэффекта дестабилизации генома, индуцированного «феромоном перенаселения» 2,5-ДМП,за счет предоставления мышам хемосигналов от самок, которых содержали поодиночке(ХСО) (эксперименты 9, 10). Поскольку ожидали, что в данном случае центральную рольв реализации гуморальных и цитогенетических эффектов занимает обонятельная система,был изучен ответ главных обонятельных луковиц на предоставление 2,5-ДМП и ХСО припомощи метода функциональной магнитно-резонансной томографии.Также было изучено, как влияет предварительная химическая инактивацияобонятельного эпителия на изменение частоты нарушений митозов в ответ напредоставление 2,5-ДМП и ХСО (эксперимент 11).
На заключительном этапе работыдополнительно изучали влияние ХСО на возникновение «спонтанных» и индуцированныхоблучением хромосомных перестроек (эксперименты 12, 13). Таким образом, вторая частьработы (рис. 7, обведено зеленым) была связана не только с выявлением генотоксическогоэффекта хемосигналов стресса, но и с изучением действия хемосигналов, оказывающихзащитный эффект на стабильность генома соматических клеток.Большинство экспериментов (эксперименты 1-5, 7-9, 12, 13) проводили на кафедрегенетики и биотехнологии СПбГУ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
