Диссертация (1145717), страница 15
Текст из файла (страница 15)
При этом эксперименты 6, 10 и 11 проводили на базеSPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН.59Эксперименты 9 и 13 проводили в двух независимых повторностях, а все остальныеэксперименты – в одной повторности.2.2.2. Эксперимент 1. Исследование влияния длительности воздействия 2,5-ДМП начастоту нарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии СВАЦель эксперимента: изучить влияние длительности воздействия 2,5-ДМП на частотунарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии CBA.Эксперимент проводили с использованием 24 самцов мышей линии СВА.Стандартная процедура воздействия 2,5-ДМП.Действующим фактором был 0,01%-ный водный раствор 2,5-ДМП (Aldrich, 97%). Нарешетке клеток с самцами размещали перфорированную капсулу, содержащуюфильтровальную бумагу с 1,5 мл раствора феромона 2,5-ДМП.
Непосредственный контактс веществом, кроме как посредством обоняния, исключался. Контролем служила группаживотных, на клетке которых размещали капсулу с дистиллированной водой.Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 4 экспериментальные группы.Каждая группа находилась в отдельном помещении и не имела воздушного контакта ссоседними.1) Первой группе предоставляли капсулу с 2,5-ДМП на протяжении 4 ч.2) Второй группе предоставляли капсулу с 2,5-ДМП на протяжении 24 ч.3) Третьей группе предоставляли 2,5-ДМП на протяжении 48 ч. При этом через 24 часавоздействия, капсулу с 2,5-ДМП обновляли, чтобы избежать испарения действующеговещества.4) Контрольной группе предоставляли капсулу с дистиллированной водой на протяжении4 ч. (Известно, что предоставление воды мышам на период 24-48 ч.
не приводит кхромосомным аберрациям (Даев, 2006)).Время начала воздействия подбирали так, что всех животных каждой группыумерщвляли методом цервикальной дислокации одновременно. Интервал между забоемживотных разных групп составлял 20 мин.Стандартная процедура фиксации костного мозга для анализа ана-телофазнымметодом.Из бедренных костей свежеприготовленным фиксатором Кларка (1 часть ледянойуксусной кислоты : 3 части этанола) вымывали костный мозг в стеклянные флаконы припомощи шприца с иглой.60Материал фиксировали и хранили в холодильнике при температуре 1-4 оС. Далеематериал анализировали ана-телофазным методом.
Перед началом анализа материалшифровали.2.2.3. Анализ препаратов костного мозга ана-телофазным методом учета нарушениймитоза и хромосомных аберрацийПриготовление препаратов осуществляли по стандартной методике (Макаров,Сафронов, 1978) с некоторыми модификациями. Небольшую часть костного мозгапомещали с помощью препаровальных игл на предметное стекло. Излишки фиксатораоттягивали фильтровальной бумагой и на материал наносили 2-3 капли 4% раствораацетоорсеина. Длительность окрашивания составляла 15-20 мин. Затем часть окрашенногоматериала помещали на чистое предметное стекло и в капле 45% уксусной кислотыаккуратно раздавливали, добиваясь монослойного распределения клеток.Рис.
8. Принцип отбора пригодных для анализа делящихся клеток костного мозга настадии анафазы-телофазы у домовой мыши (Даев и др., 2009).Анализ давленых препаратов проводили с использованием микроскопа Биолам Ипри увеличении в 640-1600 раз. Нарушения митоза: хромосомные аберрации и нарушенияпри расхождении хромосом учитывали ана-телофазным методом (Кириллова и др., 1983;Даев и др., 2009).
В связи со сложностью определения точки перехода анафазы втелофазу, эти две стадии митоза объединяли в одну под названием «ана-телофаза».61БАВДГЕРис. 9. Делящиеся клетки костного мозга самцов мыши линии СВА на стадиях анателофазы и типы выявляемых нарушений. (А) Нормальная ана-телофаза; (Б) одиночныйфрагмент; (В) одиночный мост; (Г) отставшая хромосома; (Д), (Е) множественныенарушения.
Перестройки отмечены стрелками.Масштаб – 10 мкм, указан в левомнижнем углу каждой фотографии.62От каждого животного анализировали не менее 200 делящихся клеток, находящихсяна данной стадии клеточного цикла. Пригодными для анализа считали ана-телофазы присоблюдении следующих условий (рис. 8): А) L3 (L1+L2); Б) 120о; В) хромосомусчитали отставшей при L4 0,5 (L1+ L2).
Учитывали перестройки, расположенные толькомежду расходящимися дочерними наборами хромосом (зона, обозначенная пунктиром).Среди анализируемых клеток учитывали число нормальных и перестроенных анателофаз с нарушениями следующих типов: мост, фрагмент, отставшая хромосома, а такжемножественные перестройки, в случае наличия в клетке 2-х и более перестроек (рис. 9).Определяли общую частоту делящихся клеток с нарушениями митоза любого типа, атакже соотношение частот (спектр) отдельных типов нарушений митоза.2.2.4.
Эксперимент 2. Исследование влияния 2,5-ДМП на частоту нарушений митозав клетках костного мозга самцов линии BALB/cЦель эксперимента: проверить неспецифичность генотоксического эффекта 2,5-ДМП насамцах другой линии (BALB/c).Эксперимент проводили с использованием 12 самцов мышей линии BALB/c.Действующимфакторомбыл0,01%водныйраствор2,5-ДМП(1,5мл),предоставляемый по стандартной методике (см. раздел 2.2.2).Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 2 экспериментальные группы.Каждая группа находилась в отдельном помещении и не имела воздушного контакта ссоседними.1) Первой группе предоставляли капсулу с 2,5-ДМП на протяжении 24 ч.2) Вторая группа была контрольной.
Мышам на 24 часа предоставляли капсулу сдистиллированной водой.Животных забивали через 24 часа после начала воздействия методом цервикальнойдислокации. Интервал между забоем животных разных групп составлял 20 мин.Для проведения ана-телофазного теста костный мозг фиксировали и шифровалисогласно стандартной процедуре (см. разделы 2.2.2., 2.2.3.).632.2.5. Эксперимент 3. Исследование влияния 2,5-ДМП на частоту поврежденийгенома в клетках костного мозга самцов линии СВА, выявляемых методомкометного электрофорезаЦель эксперимента: Выявить микроповреждения генома клеток костного мозгасамцов линии CBA, индуцируемые воздействием 2,5-ДМП разной длительности, методомДНК-комет.Эксперимент проводили с использованием 50 самцов мышей линии СВА.Действующимфакторомбыл0,01%водныйраствор2,5-ДМП(1,5мл),предоставляемый по стандартной методике (см.
раздел 2.2.2). Негативным контролемслужила группа животных, на решетке клетки которых размещали капсулу сдистиллированной водой. Позитивным контролем служила группа мышей, которымвнутрибрюшинно инъецировали мутаген – акриламид, разбавленный в физиологическомрастворе в концентрации 100 мг/кг, что, по литературным данным, приводит квозникновению повреждений ДНК (Sasaki et al., 2000).Рис. 10. Схема эксперимента № 3. Исследование влияния 2,5-ДМП на частотуповреждений генома в клетках костного мозга самцов линии СВА.64Протокол эксперимента.
На мышах тестировали 6 различных типов воздействий.1) Первой группе, состоящей из 4 животных, предоставляли капсулу с 2,5-ДМП напротяжении 1 ч.2) Для второго варианта воздействия (8 животных) использовали двухчасовое воздействие2,5-ДМП.3) Для третьего варианта воздействия (13 животных) использовали 4-часовое воздействие2,5-ДМП.4) Четвертой группе, состоящей из 5 животных, предоставляли капсулу с 2,5-ДМП напротяжении 24 ч.5) Для пятого типа воздействия (15 животных) на клетки размещали капсулы, содержащиедистиллированную воду, на протяжении 2 ч.
(негативный контроль). (Продолжительностьконтрольного воздействия было выбрана из расчета, что при предоставлении мышамнового фактора пик возможного возникновения комет происходил через 2 часа(Suberbielle et al., 2013)).6) Мышам шестой группы (5 животных) за 8 часов до взятия костного мозга была сделанаинъекция акриламида из расчета 100 мг/кг (позитивный контроль) (Sasaki et al., 2000).Время начала воздействия подбирали так, что всех животных каждой группы (иликлетки – если в группе было больше 6 животных) умерщвляли методом цервикальнойдислокации одновременно. Интервал между забоем животных разных групп составлял 20мин.
Для проведения кометного электрофореза из бедренной кости раствором фосфатносолевого буфера (PBS, Invitrogen, pH=7,4) вымывали костный мозг в стеклянные флаконы.Далее материал пипетировали до получения гомогенной опалесцирующей суспензии,которую использовали для последующих процедур.Далее материал анализировали методом щелочного кометного электрофореза. Передначалом анализа материал шифровали.2.2.6. Метод щелочного кометного электрофорезаДля оценкиповрежденностигенома клетоккостного мозга использовалистандартную методику щелочного кометного электрофореза (Дурнев и др., 2006) снебольшими модификациями.Получение микропрепаратов.10 мкл суспензии клеток костного мозга вносили под покровное стекло камерыГоряева и просчитывали количество клеток в неразведённой суспензии, доводя его при65помощи PBS до концентрации 2-3×105 клеток на 1 мл.
1 мл суспензии переносили вмикроцентрифужную пробирку.Для получения подложки микропрепаратов использовали традиционно применяемыев световой микроскопии предметные стекла с двусторонним матированным полем длямаркировки. Для начала их покрывали 0,01% водным раствором полилизина (SigmaAldrich) и доводили до полного высыхания.
Далее в стеклянной посуде готовили 1%раствор универсальной агарозы (Тпл<65 °С). Горячий агарозный гель дозатором (по 150мкл) наносили на край стекла, противоположный шероховатому, и наконечником дозатораплашмя растягивали гель по всей гладкой поверхности и на 3-5 мм по шероховатой.Подготовленные таким образом предметные стекла с агарозой клали на плоский планшети помещали в суховоздушный термостат (Т=70 °С) на ночь.Приготовленную ранее суспензию индивидуальных клеток смешивали с растворомлегкоплавкой агарозы. Для этого сначала готовили 1% раствор легкоплавкой агарозы(Тпл<42 °С) (type VII, Sigma-Aldrich) в растворе таблетированного PBS (pH=7,4).Полученный гель разливали на аликвоты по 150 мкл в микроцентрифужные пробирки,помещенные в твердотельный микротермостат (CH-100, «BioSan») при температуре 38 °С.В микроцентрифужные пробирки с агарозным гелем вносили 150 мкл суспензиииндивидуальных клеток и несколько раз прокачивали дозатором для достиженияравномерного распределения клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
