Диссертация (1145717), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Подготовленные предметные стекла раскладывалина автоматическом нагревательном столике (ТС-70, «ФМП») с нагретой до 37 °Споверхностью. В центральную часть предметного стекла наносили 300 мкл полученногоагарозного геля с клетками и накрывали покровным стеклом (25×25 мм). Предметныестекла клали на плоский планшет и помещали на 10 мин. в холодильник (при температуре4 °С) для затвердевания геля. Все последующие операции проводили в темноте.
Послезатвердевания геля капали на каждый слайд 150 мл лизирующего раствора.Неполный лизирующий раствор готовили за день до эксперимента. Он содержал 10мMоль/л Tris-HCl (pH=10), 2,5 Mоль/л NaCl, 100 мMоль/л EDTA-Na2. В деньэксперимента готовили рабочий лизирующий раствор путем добавления к исходномураствору Triton X-100 (95%, Helicon) до конечной концентрации 1%. Готовый растворперед использованием охлаждали до 4°С.Накрывали микропрепарат полоской парафильма и оставляли на 1 час.
После лизисастекла отмывали в PBS от лизирующего раствора.В качестве буфера, непосредственно контактирующего с живыми клетками,использовали таблетированный PBS (Invitrogen), а для отмывания препаратов припереносе из одного раствора в другой использовали PBS, приготовленный вручную. Для66этого готовили 100 мл двадцатикратного раствора PBS, смешивая 61 мл 0,2 Моль/лNa2HPO4 и 39 мл 0,2 Моль/л NaH2PO4. В день эксперимента к 45 мл двадцатикратногораствора PBS добавляли 455 мл дистиллированной воды и 0,22г KCl и 0,87г NaCl(pH=7,4).Далее микропрепараты помещали в камеру для электрофореза COMPAC-50(Cleaver), заполненную буфером для электрофореза, и оставляли на 20 минут безнапряжения для релаксации хроматина.Буфер для электрофореза готовили непосредственно в день эксперимента – 300мMоль/л NaOH, 1 мMоль/л EDTA-Na2, (pH>13).
Перед применением его охлаждали до4°С.Электрофорез проводили в течение 20 минут при напряжении поля 1В/см.Использовали источник питания C.B.S Scientific, EPS-300 X Mini-Power Supply. Послеэлектрофореза стекла помещали в кювету и заливали раствором для фиксации (70%раствор этилового спирта). Фиксацию проводили в течение 15 мин. Микропрепаратывысушивали при комнатной температуре (1-2 часа).Окрашивание и микроскопический анализ.Для окраски микропрепаратов использовали 0,1% раствор SYBR Green I (SigmaAldrich).
В затемнённой комнате на каждый микропрепарат наносили 150 мл раствора иоставляли в горизонтальном положении в течение 20 мин. Затем микропрепараты триждыпромывали в дистиллированной воде и анализировали на эпифлуоресцентном микроскопе(Axio Scope.A1, Zeiss) с соответствующими для красителя SYBR Green I фильтрами:длина волны возбуждающего света задавалась фильтром 516-560 нм, отсекающий фильтр590 нм. Анализ «ДНК-комет» проводили с помощью программно-аппаратного комплекса.Программно-аппаратный комплекс включает в себя совмещенную с микроскопомвысокочувствительнуюCCD-камеру (QImaging, QI Click) испециализированноепрограммное обеспечение (Comet Score™). Микрофотометр ССD-камеры производилцифровую регистрацию параметров «ДНК-комет», что в дальнейшем позволилоопределить количество ДНК, мигрировавшее к аноду.
На каждый микропрепаратфотографировали не менее 200 клеток («ДНК-комет»).Анализ фотографий ДНК-комет.Для обработки полученных в ходе наших экспериментов цифровых изображенийбылаиспользованакомпьютернаяпрограммаCometScoreTM.Напервомэтапекомпьютерного анализа изображения находили границы «ДНК-кометы» на основе порогаяркости, определяемого автоматически как смещение от фона, и выделяли ее впрямоугольную область. На втором этапе определяли виртуальную границу «головы» и67«хвоста» кометы, для чего по максимальной интенсивности свечения находили центр«головы кометы» и отмечали его вручную линией, разделяющей переднюю и заднюючасть «головы кометы» (рис.
11, «А»).Определение виртуальной границы «головы» и «хвоста» происходит автоматическипутем зеркального отражения распределения интенсивностей свечения точек переднейчасти «головы кометы» (рис. 11, «Б»). Затем программа измеряет длину «кометы», длину«хвоста», диаметр «головы» и вычисляет процентное содержание ДНК в «хвосте кометы».Таким образом, анализировали не менее 100 «ДНК-комет» на каждый микропрепарат. Вкачестве меры повреждения ДНК брали процентное содержание ДНК в хвосте комет отобщего количества ДНК в комете («%ДНК в хвосте»).Рис. 11. Обработка изображений в компьютерной программе CometScoreTM. (А) Стрелка 1– прямая, обозначающая центр «головы кометы», на основе которой программаавтоматически определяет виртуальную границу «головы» и «хвоста» «кометы».
Стрелка2 – прямоугольная область, обозначающая границы «кометы». (Б) Автоматическоеизмерение параметров интенсивности свечения «головы» и «хвоста» «кометы».Поврежденной считали клетки, содержащие в хвостеболее 5% от общегоколичества ДНК (Collins et al., 1997; Duthie, McMillan, 1997). Основным показателемповрежденности ДНК у мыши считали частоту поврежденных клеток. Кроме того,определяли частоту сильно поврежденных клеток с содержанием более чем 20% ДНК вхвосте кометы.682.2.7.
Эксперимент 4. Исследование влияния хемосигналов мочи котов настабильность генома в клетках костного мозга самцов линии СВАЦель эксперимента: исследовать способность другого типа ольфакторного воздействия –стрессирующего запаха хищника – индуцировать нестабильность генома в клеткахкостного мозга самцов линии CBA.Эксперимент проводили с использованием 20 самцов мышей линии СВА.Мышам предоставляли летучие хемосигналы мочи самцов домашней кошки (Feliscatus L.). Донорами мочи служили два половозрелых беспородных самца в возрастеполутора лет, диета которых включала мясные продукты.
Сразу после сбора мочи еезамораживали и хранили до использования не более двух месяцев при температуре -20 °С.Для воздействия МК на решетках клеток с мышами с внешней стороны размещалиперфорированную капсулу с фильтровальной бумагой, содержащей 100 мкл смеси мочиобоих котов, разбавленной 400 мкл дистиллированной воды. Контролем служила группаживотных, на клетке которых размещали капсулу с дистиллированной водой. Прямойконтакт с веществом исключали. Таким образом, воздействие осуществляли тольколетучими веществами.Протокол эксперимента.
Мыши были разделены на 4 экспериментальные группы.Каждую группу содержали в отдельном помещении, не имеющем воздушного контакта ссоседними.1) Первой группе, состоящей из 5 мышей, предоставляли капсулу с мочой кошки напротяжении двух часов.2) Второй группе, состоящей из 5 мышей, предоставляли капсулу с мочой кошки напротяжении 24-х часов.3) Третья группа, состоящая из 8 мышей, была контрольной.
Мышам предоставлялиперфорированную капсулу, содержащую фильтровальную бумагу с дистиллированнойводой.4) Двум мышам, для проверки работоспособности теста ДНК-комет, за 6 часов до взятиякостного мозга была сделана инъекция акриламида (100 мг/кг) что, по литературнымданным, приводит к возникновению повреждений ДНК (Sasaki et al., 2000).После завершения воздействий животных забивали методом цервикальнойдислокации. Время начала воздействия подбирали так, что всех животных каждой группы69умерщвляли методом цервикальной дислокации одновременно. Интервал между забоемживотных разных групп составлял 20 мин.У 5 мышей из контрольной группы и 5 мышей, подвергнутых 24-часовомувоздействию хемосигналами мочи кошки, костный мозг фиксировали и шифровали дляпроведения ана-телофазного теста согласно стандартной процедуре (см. разделы 2.2.2.,2.2.3.).Кроме того, для проведения кометного электрофореза из другой бедренной костираствором фосфатно-солевого буфера (PBS, Invitrogen, pH=7,4) вымывали костный мозг встеклянныефлаконы.Далеематериалпипетировалидополучениягомогеннойопалесцирующей суспензии, которую использовали для проведения щелочного кометногоэлектрофореза (см.
пункт 2.2.6). Перед началом анализа материал шифровали.2.2.8. Эксперимент 5. Исследование влияния 2,5-ДМП и иммобилизационного стрессана частоту нарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии C3HЦель эксперимента: сопоставить генотоксический эффект 2,5-ДМП и иммобилизации насамцах ранее не исследованной нами линии мышей C3H.Эксперимент проводили с использованием 18 самцов мышей линии С3Н.Действующимфакторомбыл0,01%водныйраствор2,5-ДМП(1,5мл),предоставляемый по стандартной методике (см.
раздел 2.2.2).Для иммобилизации предварительно изготавливали иммобилизационную камеру из50 мл пластиковых центрифужных пробирок с крышкой, проделывая в них отверстия длядыхания и вентиляции животного, а также – для хвоста по ранее описанной методике смодификациями (Higashimoto et al., 2013).Всего было использовано 6 камер – индивидуально для каждой особи в группе.Каждое животное фиксировали в иммобилизационной камере, которую помещали на 2часа в ту же клетку, где особей содержали до начала воздействия.В качестве контроля использовали группу особей, которые свободно передвигалисьв клетке.
При этом на решетку клетки помещали капсулу с фильтровальной бумагой,содержащей дистиллированную воду.70Рис. 12. (по: Higoshimoto et al., 2013) Изготовленная в лабораторных условиях камера дляиммобилизации домовой мыши.Протокол эксперимента. Мыши были разделены на 3 экспериментальные группы.Каждая группа находилась в отдельном помещении и не имела воздушного контакта ссоседними.1) Первой группе предоставляли капсулу с 2,5-ДМП на протяжении двух часов, после чегокапсулу убирали, и мышей на 22 часа оставляли в клетке без дополнительныхвоздействий.2) Вторую группу мышей индивидуально размещали в иммобилизационных камерах на 2часа, тем самым ограничивая свободу передвижения особей. После завершенияиммобилизации мышей на 22 часа оставляли в клетке без дополнительных воздействий.
.3) Третья группа была контрольной. Передвижение особей не ограничивали, а на решеткеклетки на 2 часа размещали перфорированную капсулу, содержащую фильтровальнуюбумагу с дистиллированной водой, а затем на 22 часа оставляли мышей в клетке бездополнительных воздействий.Животных забивали через 24 часа после начала воздействия методом цервикальнойдислокации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
