Диссертация (1145717), страница 21
Текст из файла (страница 21)
У мышей этой группы средняя частота поврежденных клеток составляла 98%, асильно поврежденных клеток – 56,4%.93Рис. 23. Средняя частота поврежденных ядер клеток костного мозга (M ± SE, %), ссодержанием > 5% ДНК в хвосте кометы (А) и сильно поврежденных ядер клеток ссодержанием ДНК в хвосте кометы >20% (Б), у самцов линии СВА после воздействийразличной длительности.
Варианты воздействия: «К» – контроль; «ДМП-1, 2, 4, 24» –воздействие 2,5-ДМП в течение 1 часа, 2 часов, 4 часов и 24 часов, соответственно; «АКР»– инъекция акриламида. Звездочками помечены достоверно различающиеся группы («*»– p<0,05; «**» – p<0,01; «***» – p<0,001), критерий ANOVA. Под графиками изображеныпримеры внешнего вида комет у мышей из контрольной группы, мышей последвухчасового воздействия 2,5-ДМП и после инъекции акриламида.Таким образом, показано, что воздействие 2,5-ДМП приводит к увеличениюповрежденности ДНК в клетках костного мозга самцов линии CBA при 2- и 4-часовомвоздействии.
Оставалось неясным, будет ли эффект дестабилизации генома индуцировандействием других хемосигналов, например, такого стрессора мышей, как моча хищника.3.4. Эксперимент 4. Исследование влияния хемосигналов мочи котов настабильность генома в клетках костного мозга самцов линии СВАОценкачастотынарушениймитозаана-телофазнымметодомумышей,подвергнутых 24-часовому воздействию хемосигналами мочи котов (МК), показала, чтоданные внутри групп распределены нормально. Средняя частота митотических94нарушений у животных контрольной группы составляла 2,81%, а 24-часовое воздействиеМК приводило к повышению частоты нарушений митоза в 1,6 раза (t-критерий, p=0,0014)до уровня 4,43% (Рис.
24, «А»).Рис. 24. Изменение средней частоты (А) и спектра (Б) нарушений митоза, а также –степени поврежденности ДНК (В), (Г) в клетках костного мозга самцов СВА приразличных по длительности воздействиях мочой котов Felis catus.«К» - негативный контроль. «МК2ч» и «МК24ч» - воздействие хемосигналами мочи котовв течение 2 или 24 часов, соответственно. «АКР» - инъекция акриламида.(В), (Г) Средняя частота поврежденных ядер клеток костного мозга с содержанием ДНК вхвосте кометы >5% (В) и сильно поврежденных ядер клеток с содержанием ДНК вхвосте кометы >20% (Г).На графике указаны значения M ± SE, %.
Звездочками помечены достоверноразличающиеся группы («*» – p<0,05; «**» – p<0,01; «***» – p<0,001). Использовали: tкритерий (для анализа частоты нарушений митоза); ANOVA и критерий КраскелаУоллиса (для анализа данных «метода комет»).95Спектр хромосомных нарушений не изменялся: в обеих группах основными типаминарушений были одиночные мосты (38% в обеих группах) и одиночные фрагменты (38% в«Контроле» и 33% в группе «МК24») (Рис.
24, «Б»).Оценка средней частоты клеток с поврежденной ДНК (доля ДНК в хвосте кометыболее 5%) (Collins et al., 1995), выявляемых методом щелочного кометного электрофореза,показала, что данные внутри каждой из групп распределены нормально. Средняя частотаповрежденных клеток в «негативной» контрольной группе («К») составляла 15% (рис. 24,«В»). Внутрибрюшинное введение акриламида («позитивный контроль») («АКР»)повышало частоту поврежденных ядер в клетках костного мозга самцов мышей до 71%.Двухчасовое воздействие летучих хемосигналами мочи котов («МК2ч») приводило кповышению общей частоты клеток с поврежденной ДНК с 15% (у негативного контроля)до 25% (критерий ANOVA, p<0,05).
После 24-часового воздействия МК (группа «МК24»)достоверного увеличения частоты поврежденных ядер выявлено не было. Важноотметить, что при действии МК увеличение частоты клеток с поврежденной ДНК всегдаоказывается достоверно ниже, чем при действии химического мутагена – акриламида.При анализе частоты сильно повреждённых клеток (содержание ДНК в хвостекометы больше 20%) данные контрольной группы («К») были распределены не нормально(рис. 24, «Г»), поэтому для сравнения использовали критерий Краскела-Уоллиса.Достоверные отличия были обнаружены между группой «МК2ч» (5,6% сильноповрежденных клеток) и «Контролем» (соответственно, 1,3%) (p<0,01). Частота сильноповрежденных клеток у мышей, подвергнутых 24-часовому действию мочи котов,составляла 3,2% и не отличалась ни от контрольных животных («К»), ни от группы «МК2ч».
После инъекции акриламида («АКР») у мышей происходило достоверное повышениечастоты сильно поврежденных клеток (до 42%), по сравнению со всеми группами.Таким образом, было продемонстрировано, что классический ольфакторныйстрессор мышей – моча котов приводит к дестабилизации генома клеток костного мозгасамцов линии CBA. На следующих этапах работы планировали сравнить силу испецифику генотоксического эффекта ольфакторного воздействия 2,5-ДМП и острогоиммобилизационного стресса, а также – проверить эффекты 2,5-ДМП на мышах новойлинии.963.5. Эксперимент 5.
Исследование влияния 2,5-ДМП и иммобилизационного стрессана частоту нарушений митоза в клетках костного мозга самцов линии С3H.На самцах мышей линии C3H был протестирован эффект двухчасового действия 2,5ДМП в сравнении с двухчасовым воздействием иммобилизации животных (рис. 25).Линия С3Н была выбрана для эксперимента, поскольку ранее на ней ещё не былипротестированы эффекты 2,5-ДМП, при этом она широко используется в экспериментахпо изучению стресса (Shanks et al., 1991), и значительно отличаются от мышей BALB/c похарактеру протекания симпатического стресс-ответа.
Кроме того мыши также являетсямоделью для изучения онкологических заболеваний (Peraino et al., 1973), что можетсвидетельствовать об усиленной геномной нестабильности у мышей этой линии.Забор материала происходил через 22 часа после завершения воздействия (2часового предоставления 2,5-ДМП или 2-часовой иммобилизации), после чего проводилианализ ана-телофазным методом. Данные внутри всех трех групп были распределенынормально.У мышей контрольной группы (предоставление дистиллированной воды) уровеньнарушений митоза в делящихся клетках костного мозга составил 2,6% (рис. 25, «А»).Было обнаружено, что иммобилизация, как и воздействие 2,5-ДМП, приводила кдостоверному повышению уровня нарушений митоза (НМ) (p<0,001).
В случаеиммобилизации повышение происходило в 1,7 раза до уровня 4,3%. В случае запаховоговоздействия 2,5-ДМП повышение происходило в 1,8 раз до уровня 4,8%. При этом спектрперестроек у контрольных мышей и у мышей при воздействии 2,5-ДМП не отличался другот друга (рис. 25, «Б»), однако достоверно отличался от спектра перестроек у мышей,подвергнутых иммобилизации (критерий χ2, p<0,05). Доля множественных перестроек умышей контрольной группы (55%) и группы «ДМП 2ч +22ч» (44%) являлась наибольшей,по сравнению с другими типами нарушений.
Частота одиночных мостов, одиночныхфрагментов и отставших хромосом составляли у животных этих групп от 15 до 20%нарушений (для каждого из типов нарушений).После иммобилизации соотношение изменялось в сторону увеличения частотыодиночных мостов (44%), а доля множественных перестроек составляла только 25%.97Рис. 25. (А) Изменение частоты нарушений митоза (M ± SE, %) в клетках костного мозгасамцов C3H при 2 часовом воздействии 2,5-ДМП «ДМП» и при 2-часовой иммобилизации(«ИММ»); забор материала проводили через 22 часа после окончания воздействий.
«К» –контроль. Звездочками помечены достоверно различающиеся группы («***» – p<0,001),критерий ANOVA. (Б) Спектры различных нарушений митоза, у контрольной группы, придействии 2,5-ДМП и иммобилизации. Звездочками помечены достоверно различающиесяспектры («*» – p<0,05; критерий χ2).Таким образом, было показано, что 2-часовое действие как иммобилизации, так и2,5-ДМП повышает частоту нарушений митоза в клетках костного мозга мышей линииC3H, причем сила эффектов была сопоставимой. Кроме того, генотоксический эффект 2,5ДМП был подтвержден на новой линии мышей – C3H. При этом механизмы действия 2,5ДМП на гормональном уровне оставались не выявленными.3.6.
Эксперимент 6. Исследование влияния 2,5-ДМП и хемосигналов самок-одиночекна изменение концентрации гормонов в крови самцов линии СВАСледующий эксперимент был посвящен выявлению гормональных изменений придействии 2,5-ДМП. Чтобы выявить специфику эффектов 2,5-ДМП сравнивали эффектданного феромона с действием других хемосигналов мышей.
Поскольку 2,5-ДМПявляется хемосигналом самок, находящихся в переуплотненном состоянии (Novotny et al.,1986), в качестве альтернативного хемосигнала был выбран запах самок, рассаженныхпоодиночке.При изучении влияния различных хемосигналов (2,5-ДМП, подстилка самокодиночек или их совместное действие) на концентрацию гормонов в плазме крови самцов98линии СВА были выбраны 2 временные точки – 30 и 60 минут. По каждому из изучаемыхгормонов внутри групп наблюдали сильно гетерогенные результаты, поэтому все данныеобрабатывали непараметрическими методами (критериями Манна-Уитни и КраскелаУоллиса), а в качестве контроля мышам предоставляли воду (вариант «H2O»).Таблица 1. Медианные значения концентраций различных гормонов плазмы крови умышей контрольной группы через 30 и 60 минут после предъявления капсулы сдистиллированной водой.ГруппаNH2O 30 минH2O 60 минОкситоцин Кортикостерон ТестостеронЛГмклМЕ/млнГ/млнМоль/лмлМЕ/мл63,392,586,131,8263,861,397,721,540,9370,240,6990,936Тест Манна-Уитни, p значениеПримечания: в нижней строке приведены значения критерия значимости различий (тестМанна-Уитни) между двумя контрольными группами – достоверных различий необнаружено; N – количество животных в группе; ЛГ – лютеинизирующий гормон.Поскольку между группами «H2O 30 мин» и «H2O 60 мин» не было обнаруженоразличий ни по одному из изучаемых гормонов (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
