Диссертация (1141398), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Н.Н. Блохина» МинздраваРоссии и содержали в конвенциональных условиях на брикетированном рационекормления.2.2. Методы исследований2.2.1. Изучение растворимости субстанции ормустинаИзучение растворимости субстанции ормустина проводили визуально притемпературе 20±2ºС (ГФ XIII, ОФС.1.2.1.0005.15) [24].2.2.2. Приготовления парентеральной лекарственной формы «Ормустин,лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 125 мг»Получение концентратаСубстанциюормустина,хранившуюсяпритемпературе-18ºС,предварительно выдерживали при комнатной температуре в течение 10–15 мин, азатем растворяли под действием УЗ в заранее приготовленном растворе 0,1 Мкислоты хлористоводородной, охлажденном до +15ºС.
К полученному растворудобавляли частями Kollidon 17PF и растворяли до получения светло-желтогопрозрачного раствора.Стерилизация концентрата ормустинаВ связи с наличием у противоопухолевых препаратов, в том числе у группыАНМ, таких свойств, как термолабильность и высокая реакционная способность,для их стерилизации наиболее подходит метод стерилизующей фильтрации.Стерилизацию раствора ормустина проводили под вакуумом черезнейлоновые фильтры с размером пор 0,22 мкм с помощью стеклянногофильтродержателя в комплекте с колбой Millipore и через полиэфирсульфоновыефильтры системы Stericup GP Millipore Express Plus, а также под давлением черезэкструдер Lipex.
Профильтрованный раствор разливали по стеклянным флаконам.41Лиофилизация 2,5% раствора ормустинаЛиофилизацию проводили на сублимационной сушке Minifast DO.2. Приэтом раствор ормустина дозировали по 5 мл во флаконы объемом 20 мл,загружалинаполкисублимационнойсушкиилиофилизировалисиспользованием различных температурных режимов:загрузка раствора во флаконах на теплые полки (20оС) с быстрым1.замораживанием до минус 45 оС и равномерным подъемом температуры соскоростью 2-3 оС/ ч;загрузка раствора во флаконах на теплые полки (20оС) с быстрым2.замораживанием до минус 45 оС и длительным выдерживанием при даннойтемпературе (10 ч), с последующим равномерным подъемом температурысо скоростью 2-3 оС/ ч;загрузка раствора во флаконах на холодные полки (минус 45 оС) с3.быстрым замораживанием до минус 45 оС и равномерным подъемомтемператур со скоростью 2-3 оС/ ч.Графики изменения температуры при всех трех режимах приведены нарисунке 10.252015Температура, ⁰С1050-5 0510152025303540455055606570-10-151 режим2 режим3 режим-20-25-30-35-40-45-50Время, чРисунок 10 – Три режима лиофилизации раствора ормустина758042Определение эвтектической температуры в растворе ормустинаЭвтектическую температуру определяли термическим методом [60].
Приэтом флаконы с раствором замораживали до температуры минус 45оС. Последостижения заданной температуры начинали нагрев до 20±2оС. При оттаиваниинаблюдалось расслоение замороженной «таблетки» моделей ЛФ ормустина. Придостижении температуры эвтектики в нижнем слое «таблетки» образовывалсяраствор.2.2.3. Методы анализа парентеральной лекарственной формы ормустина2.2.3.1.Определениеподлинностиормустинавпарентеральнойлекарственной формеА. ТСХ-анализМетод ТСХ включен во множество нормативных документов (ФС, ТУ,мировыеироссийскаяфармацевтическомфармакопеи)анализедляиоценкитрадиционноподлинности,применяетсявколичественногосодержания и чистоты АФИ и ЛФ [23, 68, 71, 81].
С целью установленияподлинности компонентов изучаемой ЛФ можно использовать метод ТСХ.Методика анализа приведена в разделе 4.1.Б. СФМ-анализСпектроскопическиеметодыанализаоснованынаизбирательномпоглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом и служатдля исследования строения, идентификации и количественного определениясветопоглощающих соединений [12, 15, 41].ЭСП в области 200–450 нм имеет два максимума поглощения при 229±2 нми при 396±2 нм. При проведении исследования используют кюветы с толщинойслоя 10 мм.В.
ВЭЖХ-анализВЭЖХ относится к колоночным хроматографиям, где в качестве подвижнойфазы представлена жидкость, движущаяся через колонку, заполненную сорбентом(неподвижной фазой) [19, 25, 26, 111].43При проведении анализа ЛФ на хроматограмме испытуемого раствора,приготовленного для определения изомерного состава, должны обнаруживатьсядва последовательно элюирующихся пика: неактивный изомер 1 (время выхода8,0–9,0 мин) и активный изомер 2 (время выхода 11,3–12,8 мин). Более подробноданный метод описан в разделе 2.2.3.5. «Определение изомерного состава».2.2.3.2. Количественный спектрофотометрический анализ ормустина впарентеральной лекарственной формеКоличественное содержание ормустина в ЛФ определяли методом СФМ ввидимом диапазоне при длине волне 396±2 нм.
Методика анализа представлена вразделе 4.2.2.2.3.3. Определение рН в концентрате и парентеральной лекарственнойформе ормустинаОпределение рН концентрата и лиофилизата (после его регидратации)ормустина проводили потенциометрически. Измерения проводили в интервалетемператур от 20 до 25°С.2.2.3.4. Определения потери в массе при высушиванииВ предварительно высушенный и взвешенный бюкс помещали 0,5 гпрепарата и сушили до постоянной массы в вакуумном сушильном шкафу надпятиокисью фосфора при комнатной температуре и остаточном давлении 5 ммрт.ст.2.2.3.5. Определение изомерного состава ормустина в парентеральнойлекарственной формеОрмустин представляет собой смесь двух изомеров. Исследованиебиологической активности индивидуальных изомеров показало, что тольковторой изомер обладает противоопухолевой активностью, т.е.
терапевтическоедействие изучаемого препарата зависит от соотношения изомеров в ПЛФ. Дляопределения изомерного состава использовали ВЭЖХ.Приготовление испытуемого раствора: содержимое флакона растворяют вводе и количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят объем колбы44водой до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45мкм.Проведение анализа: хроматографируют испытуемый раствор, получая неменее 5 хроматограмм. Результаты анализа считаются достоверными, есливыполняются требования теста «Проверка пригодности хроматографическойсистемы».
На хроматограмме субстанции определяются два пика, соотношениеплощадей которых соответствует соотношению изомеров в субстанции.Содержание второго изомера Х2 в % вычисляют по формуле 1:Х2 S2 100 %,S 2 S1(1)где S1 – площадь пика, соответствующего первому изомеру;S2 – площадь пика, соответствующего второму изомеру.Рисунок 11 – Типичная хроматограмма ПЛФ ормустинаРаствор для определения пригодности системы: используют испытуемыйраствор.Определениепригодностихроматографическойсистемы:системасчитается пригодной, если выполняются следующие условия: относительныестандартные отклонения результатов измерений времени удерживания иплощадей пиков двух изомеров не превышают 2,0%; эффективность колонки (N),45рассчитанная для пика первого изомера не менее 10000 теоретических тарелок;разрешение (R) между пиками первого и второго изомеров не менее 6,0.
Факторасимметрии (T) пиков изомеров один и два должен быть не более 1,5.Условия хроматографирования:1. Подвижная фаза: 10 мл спирта этилового 96 % и 90 мл 0,01 М растворакалияфосфатаоднозамещенногосмешиваютвкруглодоннойколбе,перемешивают. Раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером пор0,45 мкм и дегазируют.
Срок годности раствора 24 ч.Приготовление 0,01 М раствора калия фосфата однозамещенного: около1,36 г калия фосфата однозамещенного (точная навеска) помещают в мернуюколбу вместимостью 1,0 л, растворяют в небольшом количестве воды, доводятобъем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают.2. Колонка: длина колонки – 250 мм; внутренний диаметр – 4,6 мм;адсорбент – Phenomenex Luna C18(2) с размером частиц 5 мкм. Допускаетсяиспользованиеальтернативнойколонки,удовлетворяющейтребованиямпригодности хроматографической системы.3. Детектор: спектрофотометрический, λ=230 нм.4. Объем пробы: 10 мкл.5.
Скорость потока: 0,8 мл/мин.5. Время хроматографирования: 20 мин.Пример типичной хроматограммы изомеров ормустина в ПЛФ представленна рисунке 11.2.2.3.6. Валидация методик количественного спектрофотометрическогоанализаСоответствие качества ЛП регламентируемым нормам предполагаетприменение различных аналитических методов, при этом окончательный вывод взначительной степени зависит от качества самого метода, который долженотвечать определенным требованиям. Проведение валидации гарантируетполучение достоверных и точных результатов анализа, поскольку позволяетсвоевременно выявить недостатки методики в процессе разработки [10, 14, 41].46Валидацию проводили в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0012.15«Валидацияаналитическихметодик»[24]потакимпараметрам,какспецифичность, линейность, правильность, сходимость и внутрилабораторнаяпрецизионность.2.2.4.Исследованиепротивоопухолевойактивностипарентеральнойлекарственной формы ормустина в опытах in vivoПротивоопухолевую активность готовой ЛФ ормустина изучали нанескольких опухолях: лимфоцитарной лейкемии Р-388, лимфоидной лейкемии L1210, эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC), меланома В-16, рак шейкиматки РШМ-5.Солидные и асцитные опухоли перевивали лабораторным животным постандартной методике.
При перевивке солидных моделей опухолевую тканьизмельчали ножницами до гомогенной консистенции, добавляли среду 199 досоотношения 1:10 и 0,5 мл полученной суспензии (около 50 мг опухолевыхклеток), вводили подкожно в область правой подмышечной впадины. Приперевивке асцитных опухолей гибридам первого поколения BDF1 вводиливнутрибрюшинно по 0,3 мл асцитной жидкости, разведенной средой 199 исодержащей по 1×106 опухолевых клеток. Лечение начинали через 24 ч послеперевивки гематобластозов и через 48 ч – солидных опухолей.Критериями оценки противоопухолевой активности служили:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
