Диссертация (1141398), страница 10
Текст из файла (страница 10)
На завершающем этапе работы оценено влияниерастворителей для парентерального пути введения на стабильность получаемогоприрегидратациирастворителями,лиофилизатараствораобеспечивающимиормустина.наиболееУстановлено,длительнуючтостабильностьполученного раствора являются вода для инъекций, изотонический растворнатрия хлорида, 5% раствор глюкозы и фосфатный буферный раствор.В результате проведения комплекса технологических экспериментовразработаналиофилизированнаядоклинические исследования.ПЛФормустина,котораяпереданана64ГЛАВА 4.
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПЛФОРМУСТИНАСоздание новой ЛФ предполагает разработку методик контроля качества истандартизации.Наиболееперспективнымиявляютсяоптические[12]ихроматографические [19, 64] методы анализа в связи с их простотой исполнения,экспрессностью, достаточной точностью и воспроизводимостью.4.1. Разработка методики качественного определения ормустина и Kollidon17PF в парентеральной лекарственной форме методом тонкослойнойхроматографииХроматографирование проводили с использованием пластинок «Sorbfil» истандартного образца (СО) [54]. Оценку эффективности системы растворителейпроводили по следующим параметрам:▪ количество зон адсорбции (пятен) веществ, образующихся приразделении смеси компонентов;▪ значение фактора удерживания Rf анализируемых веществ;▪ время пробега подвижной фазы.Приготовление испытуемого раствора: содержимое флакона растворяют в12,5 мл воды.Приготовление раствора стандартного образца 1 (СО-1): в мерную колбуна 25 мл отвешивают 250 мг ормустина и растворяют в небольшом количествеводы, доводят объем колбы водой до метки.Приготовление раствора стандартного образца 2 (СО-2): в мерную колбуна 25 мл отвешивают 600 мг Kollidon 17PF и растворяют в небольшом количествеводы, доводят объем колбы водой до метки.Приготовление йодной камеры: в эксикатор помещают тигель, в которыйзасыпают 1 г кристаллов йода.
Время насыщения парами – 15-20 мин.Приготовление раствора нингидрина: 0,3 г нингидрина растворяют в 100млн-бутанола,прибавляют3млЛУК.Раствориспользуютсвежеприготовленным.Описание методики: на линию старта хроматографической пластинки65размером 1510 см наносят по 5 мкл испытуемого раствора (50 мкг ормустина и120 мкг Kollidon 17PF), раствора СО-1 (50 мкг ормустина), раствора СО-2 (120мкг Kollidon 17PF). Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе втечение 10 мин, помещают в камеру, насыщенную парами подвижной фазой, ихроматографируют восходящим способом.
Когда фронт подвижной фазыдостигнет линии финиша, пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе.После этого пластинку помещают в йодную камеру, где проявляются желтыепятна Kollidon 17PF. Затем пластинку опрыскивают раствором нингидрина исушат в сушильном шкафу при температуре от 100 до 105 oС в течение 5 мин.Ормустин проявляется в виде пятен фиолетового цвета.Подбор подвижной фазы для определения ормустина в ПЛФПосле изучения литературных данных по проведению ТСХ-анализапрепаратов группы АНМ [38, 73, 96] остановились на ряде подвижных систем,которые приведены в таблице 8.Таблица 8 – Значение показателей Rf ормустина и Kollidon 17PF в различныхсистемах растворителей№п/п1.2.3.4.5.6.7.8.Подвижная фазарастворителиспирт 95%: ледянаяуксусная кислота (ЛУК):водан-бутанол: ЛУК: водапропанол-2: аммиакводныйспирт 95%: аммиакводныйн-бутанол: аммиак водныйн-бутанол: аммиак водныйэтилацетат: спирт 95%:аммиак водныйхлороформ: спирт 95%соотношениеЗначение RfормустинKollidon 17PFЛФСО-1ЛФСО-212:3:50,070,07стартстарт12:3:50,420,42стартстарт3:20,50,50,630,633:20,610,610,780,783:22:10,07старт0,07стартстартстартстартстарт10:4:10,340,350,080,097:10,630,63стартстарт66050100спирт 95%:лед.
уксусная кислота:вода…90н-бутанол:лед. уксусная кислота:вода…90150пропанол:аммиак водн 3:2спирт 95%:аммиак водн 3:2150180н-бутанол:аммиак водн 2:1хлороформ:спирт 95% 7:1250240н-бутанол:аммиак водн 3:2этилацетат:спирт 95%: аммиак водн 10:4:1200240160180Рисунок 22 – Время подъема фронта в различных системах растворителейИз всех приведенных систем наиболее быстрое (90 мин) поднятие фронтарастворителя наблюдалось в системе н-бутанол:ЛУК:вода (12:3:5), поэтому вдальнейших исследованиях для идентификации ормустина методом ТСХиспользовали данную систему. Kollidon 17PF малоподвижен, из восьми систем онподнимался от линии старта только в трех системах, причем наиболее быстрый (втечение 150 мин) подъем фронта подвижной фазы наблюдался в системе спирт95%: аммиак водный (3:2).
Поэтому если в ЛФ требуется дополнительноидентифицировать Kollidon 17PF, то следует применять систему спирт 95%:аммиак водный (3:2) (рис. 22).Оценка пригодности хроматографической системы н-бутанол:ЛУК:вода(12:3:5) для определения ормустинаОценку пригодности системы проводили путем установления пределаобнаружения вещества, для ормустина он составил 1 мкг.Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографическойсистемы 1 (ПР-1): в мерную колбу на 25 мл переносят 0,5 мл СО-1,перемешивают и доводят объем колбы водой до метки.Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографическойсистемы 2 (ПР-2): в мерную колбу на 25 мл переносят 1 мл СО-1, перемешивают67и доводят объем колбы водой до метки.Методика анализаНа линию старта хроматографической пластинки наносят пробы: 1 – 5 мклиспытуемого раствора (50 мкг ормустина); 2 – 5 мкл СО-1 (50 мкг ормустина), 3 –5 мкл ПР-1 (1 мкг ормустина), 4 – 5 мкл ПР-2 (2 мкг ормустина).Пластинку помещают в камеру, насыщенную парами системой нбутанол:ЛУК:вода (12:3:5), плотно закрывают крышкой и хроматографируют.После достижение фронтом системы линии финиша пластинку вынимают,подсушивают на воздухе, после чего пластинку опрыскивают растворомнингидрина и сушат в сушильном шкафу при температуре от 100 до 105 oС втечение 5 мин.
Ормустин проявляется в виде пятен фиолетового цвета.На хроматограмме (рис. 23) наблюдают проявление 4 пятен фиолетовогоцвета. Далее определяют значения Rf: 1 – 0,42; 2 – 0,42; 3 – 0,42; 4 – 0,42.Рисунок 23 – Хроматограмма системы н-бутанол:ЛУК:вода (12:3:5): 1 –испытуемый раствор (50 мкг ормустина), 2 – СО-1 (50 мкг ормустина), 3 – ПР-1 (1мкг ормустина), 4 – ПР-2 (2 мкг ормустина)Значение Rf и проявление четырех пятен фиолетового цвета указывает напригодность системы н-бутанол:ЛУК:вода (12:3:5).68Оценка пригодности хроматографической системы спирт 95%:аммиакводный (3:2) для определения Kollidon 17PFОценку пригодности системы проводили путем установления пределаобнаружения вещества, для Kollidon 17PF он составил 1 мкг.Приготовление раствора для проверки пригодности систем 3 (ПР-3): вофлакон на 20 мл переносят 0,1 мл СО-2, добавляют 5,9 мл воды, перемешивают.Приготовление раствора для проверки пригодности системы 4 (ПР-4): вофлакон на 20 мл переносят 2 мл ПР-3, добавляют 2 мл воды, перемешивают.Методика анализаНа линию старта хроматографической пластинки наносят пробы: 1 – 5 мклиспытуемого раствора (50 мкг ормустина, 120 мкг Kollidon 17PF); 2 – 5 мкл СО-2(120 мкг Kollidon 17PF), 3 – 5 мкл ПР-3 (2 мкг Kollidon 17PF), 4 – 5 мкл ПР-4 (1мкг Kollidon 17PF).Пластинку помещают в камеру, насыщенную парами системой спирт95%:аммиак водный (3:2), плотно закрывают крышкой и хроматографируют.После достижение фронтом системы линии финиша пластинку вынимают,подсушивают на воздухе.
Kollidon 17PF проявляют помещением пластинку вйодную камеру. Kollidon 17PF проявляется в виде пятен ярко желтого цвета.Наблюдают проявление 4 пятен желтого цвета со значением Rf: 1 – 0,78; 2 –0,78; 3 – 0,78; 4 – 0,78 (рис. 24).69Рисунок 24 – Хроматограмма системы спирт 95%: аммиак водный (3:2)после йодной камеры: 1 – испытуемый раствор (120 мкг Kollidon 17PF), 2 – СО-2(120 мкг Kollidon 17PF), 3 – ПР-3 (2 мкг Kollidon 17PF), 4 – ПР-4 (1 мкг Kollidon17PF)Затем пластинку опрыскивают раствором нингидрина и сушат в сушильномшкафу при температуре от 100 до 105 oС в течение 5 мин.
Ормустин проявляется ввиде пятна фиолетового цвета (рис. 25).Рисунок 25 – Хроматограмма системы спирт 95%: аммиак водный (3:2): 1 –испытуемый раствор (50 мкг ормустина, 120 мкг Kollidon 17PF), 2 – СО-2 (120мкг Kollidon 17PF), 3 – ПР-3 (2 мкг Kollidon 17PF), 4 – ПР-4 (1 мкг Kollidon 17PF)70Значение Rf и проявление четырех пятен ярко желтого цвета и одного пятнафиолетового цвета указывает на пригодность системы спирт 95%: аммиак водный(3:2).4.2.
Разработка методики количественного определения ормустина впарентеральной лекарственной формеПо химической структуре молекула ормустина является производнымаминокислоты, содержащим в своем составе амино- и карбоксильную группу,легко гидролизуемый атом хлора и хромофорную нитрозо-группу. Наличиеданных групп позволяет использовать различные методы для количественногоопределения препарата: СФМ [12, 15, 44], полярографию, хроматографическийанализ, а также титрование амино- и карбоксильной группы или иона хлора.Ормустин является химически нестабильным веществом, поэтому большоезначениеимеетвремяпробоподготовки.Наиболеепростымизвышеперечисленных методов является СФМ, основанный на хромофорных свойствахнитрозо-группы [41].Электронный спектр субстанции имеет две полосы поглощения: одну,интенсивную, с максимумом поглощения вблизи 228±2 нм и другую, меньшейинтенсивности, с максимумом при 396±2 нм.
Обе эти полосы можно использоватьдля количественного определения ормустина, но использование коротковолновойполосы сопряжено с большой вероятностью случайных и систематическихошибок. Многие органические соединения, в том числе примеси ормустина,поглощают в этой области спектра. По этой причине определение содержанияормустина в ЛФ проводили при λ=396±2 нм.Kollidon 17PF и раствор 0,1 М хлористоводородной кислоты, входящих всостав ЛФ, не поглощают в диапазоне 350-450 нм (рис.26), поэтому чтобыупростить процесс измерения СО и раствор сравнения готовили без Kollidon17PF.71Рисунок 26 – УФ-спектры поглощения ПЛФ ормустина (1), субстанцииормустина (2), 6% раствора Kollidon 17PF (3) и раствора 0,1 Мхлористоводородной кислоты (4)При подборе методики разведения остановились на определении линейнойзависимости оптической плотности от концентрации.
В качестве растворителяиспользовали раствор 0,01 М хлористоводородной кислоты, в котором умереннорастворимы субстанция и ЛФ ормустина. Изготавливали по 5 образцов сконечным содержанием ормустина в разведении от 0,5 до 2,5 мг/мл.Для разведений субстанции и ЛФ линейную зависимость оптическойплотности от концентрации наблюдали во всем исследуемом диапазоне (рис. 27 и28), что указывает на соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера.72Оптическая плотность0.90.80.70.60.50.40.30.20.1000.511.522.53Концентрация ормустина, мг/млРисунок 27 – Соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера для субстанцииормустина при длине волны 396±2 нм в растворе 0,01 М хлористоводороднойкислотыОптическая плотность0.90.80.70.60.50.40.30.20.1000.511.522.53Концентрация ормустина, мг/млРисунок 28 – Соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера для ПЛФормустина при длине волны 396±2 нм в растворе 0,01М хлористоводороднойкислотыПри разработке состава ЛФ готовили растворы с различной концентрациейормустина, поэтому каждый раз проводили корректировку разведения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
